Бактериологическая диагностика туберкулёза

и

Идентификация микобактерий. Несмотря на то, что морфология коло­ний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое представле­ние о выделенном штамме микобактерий, для установления их видовой при­надлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов. В 1970-х гг. Международной рабочей группой по таксономии микобак­терий была стандартизована серия высоко воспроизводимых биохимических тестов, которые не требуют сложного технического обеспечения и могут быть проведены за несколько часов или дней. Это способность штамма микобакте­рий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуци­ровать уреазу, проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазная активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме это­го, для идентификации микобактерий используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах, способность микобактерий обра­зовывать корд-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при разных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, пара-нитробензойную кислоту или салициловокислый натрий.

Методы определения лекарственной чувствительности микобакте­рий. В лабораторной практике используют три основных метода определения лекарственной чувствительности микобактерий: метод абсолютных концентра­ций; метод соотношения резистентности; метод пропорций.

Метод абсолютных (предельных) концентраций заключается в следую­щем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих проти­вотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) и непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий). Прямой способ позволяет значительно ускорить процесс полу­чения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бактериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве. Лекарственную чувствительность можно опре­делять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна-Йенсена, не содержа­щей крахмала, которая принята ВОЗ в качестве международного стандарта. Унификация определения лекарственной чувствительности МБТ позволяет по­лучать сравнимые результаты при проведении эпидемиологических исследова­ний. При определении лекарственной чувствительности на плотных питатель­ных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБТ на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12 дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка.

Определение лекарственной чувствительности на плотных и жидких пи­тательных средах имеет свои преимущества и недостатки. На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. При массовых исследова­ниях этот метод менее трудоемок, однако он более продолжителен по времени получения результата. В плотных средах во время свертывания может несколь-

12

ко уменьшаться содержание некоторых термолабильных препаратов, например, стрептомицина. Определение лекарственной чувствительности на жидких сре­дах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат может быть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять ми­кобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или паукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчиво­сти к препарату.

Метод соотношения резистентности (resistance ratio method) заключа­ется в определении соотношения минимальных ингибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штамма H37R.V, чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует штамм как чувствительный, 8 и более — как устойчивый.

Вариантом метода минимальных ингибирующих концентраций является E-test. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого ме­тода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувст­вительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингиби-рования роста микобактерий вокруг полоски. Использование E-test позволяет определять лекарственную чувствительность МБТ в течение 5-10 дней.

Метод пропорций был предложен Canetti в 1963 году. Он заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции ре­зистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в клас­сическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических систем ВАСТЕС, MGIT, Esp Culture System и др.

Целью интерпретации результатов определения лекарственной чувстви­тельности МБТ к ПТП являются прогнозирование клинической эффективности ПТП у конкретного больного и обоснование рекомендаций по проведению оп­тимальной химиотерапии.

В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувстви­тельных или устойчивых используют пороговые значения минимальных инги­бирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микро­биологических, фармакокинетических и клинических показателей. Данные о величине МИК ПТП в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных, служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций. Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают дан­ные по фармакокинетикс ПТП. Основным показателем при этом является мак­симальная концентрация ПТП, которая создается в сыворотке крови после приема ПТП в среднетерапевтической дозе. Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует. В самом общем виде

13

можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови. И, наконец, третьим критерием для определе­ния пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТП при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИК ПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результа­том точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматри­вают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых зна­чений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа ин­терпретации результатов оценки чувствительности МБТ к ПТП.

Биологические методы диагностики туберкулеза

Биологическая проба (биопроба). Биопроба является еще одним мето­дом выявления микобактерий. Для этого чувствительных к туберкулезу живот­ных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взя­тым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибнет, его забивают. Морских свинок, забитых или погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза из лимфатических узлов, легких, пече­ни, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительность биологического метода выявления микобактерий вы­сока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда корре­лирует с данными клинико-рентгенологического обследования.

Определение вирулентности штаммов микобактерий. Как и в общей микробиологии, при туберкулезе под вирулентностью понимают степень пато­генное™, то есть способность штамма МБТ размножаться в организме хозяина и вызывать в нем специфические патоморфологические изменения. Вирулент­ность МБТ обусловливается биологическими особенностями возбудителя ту­беркулеза, с одной стороны, и степенью резистентности макроорганизма — с другой. Определенная степень вирулентности присуща конкретному штамму МБТ и является не видовым (как патогенность), а индивидуальным признаком. Наиболее чувствительными животными для определения вирулентности мико­бактерий туберкулеза являются морские свинки, обладающие слабой естест­венной защитой против туберкулезной инфекции.

Для изучения вирулентности микобактерий суспензию штамма МБТ вво­дят подкожно двум морским свинкам в паховую область и ведут наблюдение за их весом, поведением, местными изменениями. Погибших морских свинок вскрывают. Для оценки степени вирулентности МБТ используют несколько критериев. Один из них — продолжительность жизни лабораторных животных,

14

использованных в эксперименте. К высоковирулентным относят культуры, вы­бывающие гибель морских свинок от генерализованного туберкулеза в период до 45 дней после заражения, к средневирулентным — при гибели через 1,5-3 месяца, к слабовирулентным — при гибели через 3-5 месяцев и более. Виру­лентность культур МБТ можно оценивать также по степени пораженное™ внутренних органов, выраженной в баллах (по М.В. Триус). По этой схеме спе­цифические изменения в органах и лимфатических узлах зараженных свинок оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые за­тем переводятся в цифровые показатели. Одним плюсом обозначается наличие единичных очагов в органе (селезенке, печени, легком), тремя плюсами — то­тальное поражение, двумя — промежуточная степень поражения. При исследо­вании лимфатических узлов каждый плюс оцениватся в 1 балл, селезенки — в 2, печени — 3, легких — 4 балла. Таким образом, при максимальных специфи­ческих изменениях цифровое обозначение поражения выражается цифрой 30. Е.Ф. Чернушенко разработана схема макроскопической оценки поражения внутренних органов морских свинок, зараженных туберкулезом, согласно кото­рой максимальное поражение организма оценивается в 100 баллов. Эта схема позволяет проводить статистическую обработку результатов. Вирулентность культур микобактерий можно оценивать также по индексу пораженности, предложенному Mitchison. Данный индекс рассчитывают как квадратный ко­рень из отношения пораженности внутренних органов, выраженной в баллах, к числу прожитых животным дней. Такой способ оценки учитывает скорость раз­вития специфических поражений во внутренних органах лабораторных живот­ных. При величине индекса пораженности 1 и более штамм микобактерий от­носят к высоковирулентным.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Полимеразная цепная реакция. Получение более совершенных пита­тельных сред, разработка автоматических систем позволяют сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются дос­таточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно-генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствитель­ностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале.

Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический ме­тод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т. е. умно­жения нуклеиновых кислот. Он был открыт в середине 1980-х гг. Kary Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США). За это открытие ав­тор был удостоен Нобелевской премии. В последние годы ПЦР становится од­ним и) наиболее широко используемых в современной медицине и биологии методов. И частности, в настоящее время выпускаются диагностические наборы кии НЦ1\ которые используются для выявления ВИЧ, вируса гепатита С, ЦМВ,

15

микобактерий туберкулеза и т. д. в различных диагностических материалах. ПЦР имитирует естественный процесс репликации ДНК, при котором число ее молекул удваивается после каждого цикла. Одно из отличий заключается в том, что ПЦР используется для амплификации не всей хромосомы, а лишь неболь­шого участка ДНК, специфичного для данного вида (последовательность-мишень).

Как известно, при репликации одна цепочка ДНК служит матрицей, на которой с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная ей вто­рая цепочка. Удвоение ДНК с помощью полимеразы происходит от 5'- к З'-концу каждой цепочки. Названия «3'» и «5'-конец ДНК» обусловлены по­следовательностью соединения нуклеотидов в цепочке. Направленность цепей в двухцепочечной молекуле ДНК противоположна, т. е. 3'-конец одной цепочки всегда взаимодействует с 5'-концом второй цепочки. Противоположную на­правленность цепей часто выражают термином «антипараллельность». При продвижении ДНК-полимеразы по молекуле ДНК на одной цепочке сразу син­тезируется сплошная комплементарная цепь, на другой происходит синтез не­больших фрагментов ДНК, получивших название фрагментов Оказаки, которые затем сшиваются при помощи фермента лигазы. Для начала работы ДНК-полимеразы необходим участок двухцепочечной ДНК, с которого начинается репликация. Небольшой участок РНК, с которого начинается удвоение ДНК, получил название праймера, или затравки.

Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах. На первом этапе двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева инкубационной системы до 90-95°С. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор, пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими после­довательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР — умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации нагревается до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermits aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Да­лее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической прогрессии.

На практике из патологического материала, взятого от больных, при по­мощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и проводят ам­плификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учиты­вают с помощью электрофореза в агарозном геле или с помощью иммобилизо­ванных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выяв-

16

Пять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфич­ность реакции — 97-98%.

Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.

Следует отметить, что с помощью ПЦР нельзя определить активность ту­беркулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необ­ходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно ис­пользовать как дополнительный диагностический метод при дифференциаль­ной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выяв­ления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль­татов. Кроме того, препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагно­стических наборов.

ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобак-терий. В табл. 5 представлены другие амплификационные методики, позво­ляющие обнаруживать микобактерии.

Таблица 5 Амплификационные методы, используемые для детекции микобактерии

Амплификация последовательности-мишени
PCR	Трехэтапный температурозависимый синтез двухцепочечной ДНК
ТМА	Изотермальный синтез РНК
SDA	Изотермальный синтез одно- и двухцепочечной ДНК
NASBA	Изотермальный синтез РНК
Амплификация праймеров
LCR	Трехэтапный температурозависимый синтез двухцепочечной ДНК
Q-Beta	Автокаталитическая изотермальная репликация РНК бактериофага Q-beta
Сигнальная амплификация
bDNA	Гибридизация последовательности-мишени с сигнальной последовательно­стью ДНК и амплимером (bDNA)
Инфицирование микобактериофагами
LRM	Излучение видимого света при окислении специфического субстрата лю-циферина люциферазой мутантного микобактериофага

Применение амплификационных методик для выявления различий в ге­нетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов — еще один но­вый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерии. Проводить данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых приводят к воз­никновению резистентности к противотуберкулезным препаратам. При исполь­зовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследо­вания. Главным ограничением для их применения служит существование дру­гих механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не 1>бнпружинается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к июмиашду и 40% к сфептомицину. Поэтому молекулярные методы, веро-

17

ятно, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные ме­тоды определения лекарственной устойчивости МВТ.

Генотинирование. Исследования по эпидемиологии туберкулеза в тече­ние длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтипирования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МВТ. Совершенствование молекулярно-генетических методов позво­лило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ.

Штаммы МБТ невозможно различить с помощью рутинных биохимиче­ских тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является об­щепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МБТ служил метод фаготипирования. Однако он техни­чески сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволя­ет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов.

Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотипических разли­чий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуальна для конкретного штамма (как отпечатки пальцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint).

Для типирования чаще всего используют специфичную для М. tuberculo­sis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстри­рует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательно­сти высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов М. bovis BCG

(1-2).

Метод генотипирования основан на использовании рестрикционных эн-донуклеаз, которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобак-териальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано ис­пользование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих ДНК на небольшое число крупных фрагментов.

Стандартный метод предусматривает следующие этапы: выделение ми-кобактериальной ДНК, ее рестрикцию с использованием эндонуклеаз, разделе­ние рестрикционных фрагментов путем электрофореза и детекцию последова­тельности-мишени посредством гибридизации с меченой ДНК. Полученная в результате совокупность электрофоретических полос (фингерпринт) отражает число копий данной последовательности ДНК (каждая полоса соответствует одной копии последовательности-мишени), а также гетерогенность в длине ре­стрикционных фрагментов, которая обычно является результатом точковых му­таций, создающих или уничтожающих сайты рестрикции, либо делеций или других хромосомных перестроек, что нашло отражение в термине «полимор­физм длины рестрикционных фрагментов» (Restriction Fragment Length Poly­morphism, RFLP).

18

Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимо­стью экстракции почти 1 мкг ДНК из каждого изолята. Поэтому в настоящее ■ремя разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количе­ство ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандарт­ным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бак­териях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а так­же клинических бактериоскопически положительных образцах.

Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко иденти­фицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью оп­ределения предполагаемого числа возможных генотипических вариантов в кон­кретном географическом регионе.

Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслежива­ние вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установле­на причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геном­ной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и пока­зала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полез­ность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирези­стентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозо-комиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэто­му резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом.

При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного ту­беркулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиоло­гической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окон­чательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследо­вания полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказа­тельства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распростра­нения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дак­тилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном ис-гислонштн

19

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ

1. Провести микроскопию мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Ниль-сену, а также количественную оценку результата.

2. Провести бактериоскопию мазка мокроты, окрашенного флуорохро-мами.

3. Оценить морфологию и массивность роста микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий на яичной питательной среде.

4. Проанализировать результаты бактериологического исследования у курируемых больных.

5. Проанализировать результаты определения лекарственной устойчиво­сти микобактерий туберкулеза у курируемых больных.

ЛИТЕРАТУРА

Основная

1. Перелъман М.И., Корякин В.А., Протопопова Н.М. Фтизиатрия. - 1996.

Дополнительная

1. Хоменко А.Г. Туберкулез: - 1996.

2. Чернеховская Н.Е., Свистунова А.С., Свистунов Б.Д. Туберкулез на рубеже веков. -2000.

\

ОГЛАВЛЕНИЕ

Мотивационная характеристика темы,

требования к исходному уровню знаний 3

Контрольные вопросы из смежных дисциплин 3

Контрольные вопросы по теме занятия 4

Учебный материал , 4

Возбудитель туберкулеза 4

Диагностический материал для исследования на туберкулез 5

Методы бактериологической диагностики туберкулеза 7

Биологические методы диагностики туберкулеза 14

Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза 15

Задание для самостоятельной работы студентов 20