10. Понятие вектора в генетической инженерии. Плазмиды, транспозоны и фаговые днк. Их значение при конструировании продуцентов.

Вектор – молекулы ДНК, обеспечивающая амплификацию фрагмента в растущей популяции клеток соотв вида организма.

Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 13% генома бактериальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Рплазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (Кплазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клеткехозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполняла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репликация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки.

Таким образом, плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств:

• небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. соіі снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;

• наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

• наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага X и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага X используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора.

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 1 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки I одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную репликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, названный как МП (межгенная последовательность), не существен-ный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репли-кативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепо-чечной молекулы в клетку Е. соlі приводит к ее репликации, синтезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделению фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка продолжает делиться, выделяя в окружающую среду большое коли-чество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена-одна из цепей чужеродной ДНК.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Транспозоны – участки ДНК организмов, способных к передвижению и размножению в пределах гена.

Используется для клонирования чужеродного гена и определение его нуклеотидной последовательности, получении ДНК маркеров, транскрипции in vitro, анализа функциональной активностиэндонуклеаз.