58. Ферменты, используемые в генетической инженерии. Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную плазмиду. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку.

Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа; 1) получение нужного гена; 2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены).

Получение генов. Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) воссозданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).

Введение гена в вектор. Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы — это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Перенос генов в клетки организма-реципиента. Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, наиболее распространенным способом передачи информации служит трансформация.

Трансформация — это перенос свободной ДНК, в том числе и плазмидной, в. реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходят рекомбинация и интегрирование однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента или какую-либо внехромосомную генетическую единицу.

Основные ферменты: рестриктазы, лигазы, полимеразы

58. Цикл развития каллусных клеток, понятие дифферинцировки и дедифференцировки в основе каллусогенеза. Тотипотентность и ее значение.

Каллус- неоранизованная пролиферирующая масса дедиференцированной растительной клетки.

Пролиферация- неорганизованное деление клеток путем размножения уже существующих.

Дифференцировка- потеря клетками способности делиться.

Дедифференцировка- возвращение клетками способности делиться.

ФУНКЦИИ КАЛЛУСА:

1. Защитная

2. Запасная

3. Регинерирующая

Тотипотентность- свойство растительной клетки дать начало целому организму

Гормоны роста растений:

1. Ауксины- выз. дифференцировку клетки, индуцируют синтез протеинкиназ клеточного деления

2. Цитокины- иницируют деление клеток, синтуз циклинов

Циклы развития:

1. Деление

2. Растяжение

3. Дифференцировки

4. Старения

5. Отмирания

58. Характеристика каллусных и суспензионных культур тканей растений. Понятие физиологической асинхронности и физиологической гетерогенности.

Каллус- неоранизованная пролиферирующая масса дедиференцированной растительной клетки.

ФУНКЦИИ КАЛЛУСА:

1. Защитная

2. Запасная

3. Регинерирующая

Циклы развития:

1. Деление

2. Растяжение

3. Дифференцировки

4. Старения

5. Отмирания

Каллусные культуры- плотные ткани с зонами редуцированного камбия и сосудов;

- ткани средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами

- рыхлые ткани сильно обводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки

Суспензионные- культивируют в больших объемах для получения гибридных клеток и их планировка

Физиологическая асинхронность- заключ в том, что в каждый данный момент времени клетки находится в разных фазах роста

Физиологическая гетерогенность- нестабильность генома, характеризуется возникновением анеуплодия, полиплодия и генными мутациями

58. Синтез вторичных метаболитов с использованием культуры клеток и тканей растений.

Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает всё больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.

У растений вторичные метаболиты участвуют во взаимодействии растения с окружающей средой, защитных реакицях (например, яды). К ним относятся следующие классы:

• изопреноиды

• фенолные соединения

• минорные соединения (разные авторы насчитывают 10-12 групп, в частности: небелковые аминокислоты, биогенные амины, цианогенные гликозиды, гликозиды горчичных масел (изотиоцианаты), беталаины, цианолипиды, ацетогенины, ацетиленовые производные, аллицины, ацетофеноны, тиофены, необычные жирные кисолоты, и пр.)

В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов — очень перспективное направление. Синтез вторичных метаболитов происходит главным образом в суспензионной культуре клеток, в регулируемых условиях, поэтому он не зависит от климатических факторов, от повреждения насекомыми. Культуры выращивают на малых площадях в отличие от больших массивов плантаций с необходимыми растениями. Культуры клеток растений могут синтезировать практически все классы соединений вторичного обмена, причем довольно часто в количествах, в несколько раз превышающих их синтез в целых растениях

Кроме того, в культурах клеток может начаться синтез веществ, не характерных для исходного растения, либо расширяется набор синтезируемых соединений.