7. Направления создания новых биообъектов методами генетической инженерии. Основные уровни генетической инженерии. Характеристика.

Генная инженерия- соединение фрагментов ДНК природного и синтетического проиисх. с послед введением в живую клетку.

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения, При этом следует учитывать высокие скорости роста и продуктивность микроорганизмов, их способность к утилизации разнообразных видов сырья. Широкие перспективы перед биотехнологией открывает возможность микробиологического синтеза белков человека: таким способом получены соматостатин, интерфероны, инсулин, гормон роста.

Генетическая инженерия растений включает манипуляции не только с ядерным геномом клеток, но также с геномом хлоропластов и митохондрий. Именно в хлоропластный геном наиболее целесообразно вводить ген азотфиксации для устранения потребности растений в азотных удобрениях. В митохондриях кукурузы найдены две плазмиды (S-1 и S-2), обусловливающие цитоплаз-матическую мужскую стерильность. Если селекционерам необходимо «запретить» самоопыление кукурузы и допустить лишь перекрестное опыление, они могут не заботиться об удалении тычинок вручную, если берут для оплодотворения растения с цитоплазматической мужской стерильностью. Такие растения могут быть выведены путем длительной селекции, однако генетическая инженерия предлагает более быстрый и целенаправленный метод — прямое введение плазмид в митохондрии клеток кукурузы. Отдаленной задачей пока остается применение методов генетической инженерии для улучшения пород сельскохозяйственных животных. Речь идет об увеличении эффективности использования кормов, повышении плодовитости, выхода молока и яиц, устойчивости животных к заболеваниям, ускорении их роста, улучшении качества мяса. Однако до сих пор не выяснена генетика всех этих признаков сельскохозяйственных животных, что препятствует попыткам генетических манипуляций в этой области.

Уровни:

1.Генная инженерия- прямое манипулирование рекомбинантных ДНК.

2. Хромосомная-манипул проводятся с определ группами генов или отдельн хромосом

3. Геномная или клеточная- перенос большей части либо всего ген материала из одной кл в другую.

8. Клеточная инженерия и ее использование в создании микроорганизмов и клеток растений. Метод слияния протопластов.

Клеточная инженерия — обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. Она основана на использовании принципиально нового объекта — изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности (способность клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма) — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна чительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

Большие успехи достигнуты в развитии методов получения трансгенных растений, технологий использования изолированных тканей и клеток травянистых растений, начато культивирование тканей древесных растений.

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Протопласт в целой клетке можно наблю-дать во время плазмолиза. Изолированный протопласт — это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. Изолированные протопласты — одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму-щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточно легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток животных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт благодаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные моле-кулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче-ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гибридные клетки. Таким способом можно добиться получения гибридов от растений с разной степенью таксономической удален-ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные условия для изоляции протопластов для разных объектов индивидуальны, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизнеспособные протопласты, является подбор осмотического стабилизатора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС1₂, Na₂HP0₄, КСІ). Концентрация осмотиков должна быть немного гипертонична, чтобы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов.