Используя тест Лурия и Дельбрюка, можно вычислить среднее число мутаций, основываясь на доле культур, в которых не произошло ни одной мутации (Ро) по следующей формуле:
m = —lnРо;
Частота мутаций на одну клетку за время одной генерации определяется по формуле
a= -(lnN0 ) (ln 2) N/Nt - No
где No – исходное число клеток, Nt – конечное.
ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И
ВЫДЕЛЕНИЕ МУТАНТОВ
Спонтанные мутации возникают крайне редко. Для увеличения частоты возникновения мутаций используют специальные агенты. Факторы, увеличивающие частоту мутаций получили название мутагенов.
Гибридизация эукариотических клеток
Гибридизация — процесс образования или получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала
разных клеток в одной клетке.
При размножении полученного в результате гибридизации гетерозиготного диплоида или гетерокариона происходит расщепление и деление — появление в потомстве форм, обнаруживающих не только доминантные, но и рецессивные признаки родителей. У эукариотических микроорганизмов расщепление обычно происходит при мейозе, а иногда и при митотических делениях.
Гибридизация промышленных штаммов дрожжей осложняется тем, что они во многих случаях полиплоидны, т. е. содержат несколько наборов хромосом, и у них редко наблюдается слияние клеток. Тем не менее скрещивание разных линий (и даже разных видов) сыграло важную роль в создании эффективных штаммов дрожжей, которые используются для быстрой выпечки хлеба современными промышленными методами, а также в пивоварении и в производстве спирта. При этом объединение в одном организме свойств двух родительских форм достигается в результате проявления у диплоидного гибрида всех доминантных признаков исходных клеток.
Совмещение ценных качеств родителей при гибридизации
Плазмиды и конъюгация у бактерий
Основным и обязательным генетическим элементом прокариотических клеток является хромосома, организованная в виде репликона, т. е. структуры, способной
к самостоятельной репликации.
Молекулярная масса известных плазмид варьирует от 1,5×1O6 до 3×1O8 Д (или от 1,5 до 300 МД). 1 МД (мегадальтон) эквивалентен примерно 1500 парам оснований (п. о.), что достаточно для кодирования 1—2 белков среднего размера. В клетке может содержаться от 10 до 200 копий мелких плазмид, в то время как число крупных плазмид составляет обычно 1—4 на хромосому. Иногда бактерии содержат несколько плазмид разной молекулярной массы и количество
плазмидной ДНК может быть сопоставимо с содержанием ДНК в бактериальной хромосоме.
Важнейшими компонентами плазмидного репликона являются детерминанты, регулирующие его репликацию.
Кним относятся:
1.Последовательность нуклеотидов, на которой происходит инициация репликации (oriV). Некоторые плазмиды могут содержать два и даже три таких участка.
2.Структутрый ген (гены), контролирующий репликацию (гер).
3.Генетические детерминанты, негативно контролирующие количество плазмидных копий (сор).
4.Генетические детерминанты, обеспечивающие распределение
плазмидных копий между дочерними клетками (par).
Многие плазмиды, молекулярная масса которых обычно превышает 25 МД, имеют генетические системы, детерминирующие перенос плазмид в другие клетки в результате конъюгации. Конъюгацией называется процесс генетического обмена, сопровождаемый переносом генетической информации от клетки-донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой. По способности к конъюгаиионному переносу плазмиды делят на конъюгатив-ные и неконъюгативные.
Система конъюгаиионного переноса такой плазмиды, как F-фактор, которая изучена лучше других, контролируется более чем 20 генами, занимающими область протяженностью в 33 тысячи пар оснований (т. п. о.), что составляет ~ '/з всей плазмидной ДНК (N. Davidson et al., 1975). Эта система обеспечивает осуществление двух основных этапов процесса конъюгации: во-первых, образование скрещивающихся пар и во-вторых, перенос и репликацию ДНК. Для образования скрещивающихся пар совершенно необходимы половые ворсинки — пили, которые формируются на
поверхности донорных клеток. Образование пилей контролируется 12
Неконъюгативные плазмиды не содержат детерминантов, придающих бактериальным клеткам свойства генетических доноров, и поэтому они не способны самостоятельно передаваться от одних клеток к другим. Однако такие плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Перенос неконъюгативных плазмид конъюгативными называется мобилизацией. При этом неконъюгативная плазмида является мобилизуемой, а конъюгативная — мобилизующей. Известно два основных механизма мобилизации неконъюгативных плазмид. Во-первых, перенос неконъюгативной плазмиды может осуществляться за счет продуктов tra-генов конъюгативной плазмиды. Он начинается с собственного сайта ori T мобилизуемой плазмиды и требует функционирования ее собственных генов mob. Так осуществляется мобилизация плазмид Col EI и RSF1010.
Во-вторых, неконъюгативные плазмиды могут переноситься в реципиентные клетки в составе коинтегратов с конъюгативными плазмидами. Коинтеграт представляет собой единую молекулу ДНК, в который объединены два (или более) репликона, каждый из которых способен к независимой репликации (R. Novick et al., 1976). Образование коинтегратов может происходить за счет гес А-зависимой реиипрокной рекомбинации по участкам гомологии между плазмидами (репликонами). Такие участки могут создаваться, в частности, перемещающимися генетическими элементами (IS-элементами и транспозонами). Если только один из двух репликонов несет в своем составе IS-элемент или транспозон, то между ними может образоваться коинтеграт как промежуточный продукт транспозиции. В этом случае процесс мобилизации, так же как и
процесс транспозиции, является recA-независимым. Иногда образующиеся
Плазмиды могут находиться как в автономном, так и в интегрированном состоянии по отношению к хромосоме клетки- хозяина. В последнем случае, по существу, образуется коинтеграт между плазмидой и хромосомой.
Важным свойством конъюгативных плазмид является их способность к мобилизации хромосомных генов, которая используется для получения генетических рекомбинантов у бактерий Впервые конъюгационный перенос хромосомных генов был обнаружен у Е. coli К-12 (J. Lederberg, Е. Tatum, 1946) и оказался связанным с F-фактором.
ЛИТЕРАТУРА Абрамова З.И. Введение в генетическую инженерию: Учебное
пособие для самостоятельной внеаудиторной работы студентов по курсу «Генная инженерия» /З.И.Абрамова. - Казань: Казанский университет, 2008.- 169 с.
Б.И. Барабащиков Методы изучения мутационной изменчивости микроорганизмов Учебно-методическое пособие/ - Казань: Казанский университет, 2008-42 с.
Зверева С. Д., Романов Г. А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений.-2000.-Т. 47, № 3.-С.479-488.
Калинин В.Л. Введение в молекулярную вирусологию.-СПб.: Изд- во СПбГТУ, 2002.-302 с.
Калинин В.Л. Транскрипция и регуляция экспрессии генов.-СПб.: Изд-во СП6ГТУ, 2001.-246 с.
Кочетов А.В. Генная инженерия и растения //Природа.-2007, № 3. Льюин Б. Гены.-М: Мир, 1987.-544 с.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.-М: Мир, 1984.- 480с