Модуль 3. Инженерная энзимологияЗадание

Ферментные препараты, особенности получения, применения

Ферменты – это специфические катализаторы белковой природы, вырабатываемые клетками и тканями организмов.

Это специфические катализаторы белковой природы, вырабатываемые клетками и тканями организмов и способные во много раз ускорять течение биохимических и химических реакций, не входя в состав конечных продуктов. Присутствуя во всех живых клетках, играют важную роль в процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ.

Использование ферментов в народном хозяйстве основано на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими системами субстратной специфичности.

Источниками ферментов могут быть животные, растения, микроорганизмы. Уже известны более двух тысяч ферментов, многие из которых получены как индивидуальные вещества. Однако особый интерес в качестве продуцентов ферментов представляют микроорганизмы, так как их метаболизм, работа ферментных систем осуществляются с высокой интенсивностью, которая у дрожжей в сотни раз выше, чем в клетках

Способность микробов развиваться в экстремальных условиях часто определяется спецификой их ферментов. Некоторые псевдомонады обнаруживают активный рост при 3-40С, а их ферменты активны при минус 5…100С. Экстремальный термофил Thermus aquaticus обладает ферментами с оптимумом действия при 900С. Ферменты галофильных микроорганизмов для максимальной активности требуют высоких концентраций NaCl. Отмечена уникальность ферментов у ацидо- и алкалофильных микроорганизмов. Aspergillus niger синтезирует две амилазы, одна из которых стабильна при очень низких рН. Некоторые амилазы, наоборот, требуют для активности резко щелочных условий (амилаза Bacillus sp. проявляет максимум активности при рН 10,5 ед.). Известны бактерии, развивающиеся в щелочной среде (рН 9,0 и выше) и образующие ферменты с высоким оптимумом рН.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты- специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов.

1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.

2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов. 3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

-конститутивные, синтез которых происходит постоянно;

-индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;

-репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры. Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает

проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительно- восстановительные. 5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный. Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Продуценты и среды

Микроорганизмы очень чувствительны к составу среды. Не всегда интенсивный рост микроорганизма способствуют максимальному накоплению ферментов.

Повышенное содержание микроэлементов часто приводит к торможению нормального роста. Большая часть микроэлементов вносится в среду с водой и органическими добавками (мукой, кукурузным экстрактом, жмыхом и т. д.).

Для получения ферментных препаратов культивирование микроорганизмов проводят поверхностным или глубинным способом. При глубинном культивировании можно применять растворимые и малорастворимые компоненты, но количество последних должно быть ограниченным. Целесообразнее использовать отвары или гидролизаты отходов растительного сырья (отрубей, солодовых ростков, свекловичного жома и т. д.), а также грубые фильтраты спиртовой барды, гидролизаты или плазмолизаты микробной биомассы. Питательные среды готовят на водопроводной воде, содержание СВ в них колеблется от 2,5 до 20 % в зависимости от физиологических потребностей продуцента или состава целевого

ферментного комплекса. В состав среды обязательно включается

Основными промышленными микроорганизмами для производства ферментных препаратов являются:

-грибы рода Aspergillus, Rhizopas, Penicillium;

-бактерии рода Bacillus и актиномицеты.

Подготовка посевного материала для поверхностного культивирования.

Может выращиваться на твердой питательной среде или в виде мицелиальной массы продуцента, выращенной в жидкой среде глубинным способом.

В качестве питательной среды чаще всего используют увлажненные пшеничные отруби могут добавлять солодовые

ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Влажность среды

Подготовка посевного материала для

составляет 45–56 %.

глубинного культивирования.

Посевной материал готовят глубинным способом.

Для грибов и актиномицетов — это мицелиальная масса, а для бактерий — молодая спороносящая культура. Этапы получения посевной культуры: выращивание культуры на жидкой среде в колбах на качалке; культивирование продуцента в малом и большом инокуляторе.

Принципиальная схема получения очищенных

ферментных препаратов из культур микроорганизмов

Методы очистки ферментных препаратов

•1. Экстрагирование из поверхностных культур.

•2. Концентрирование методом вакуум-выпаривания.

•3. Мембранные методы очистки

•а) Диализ

•б) Электродиализ

•с) Баромембранные методы.

•4. Осаждение ферментов

•а) Осаждение органическими растворителями

•б) Осаждение высококонцентрированными растворами солей

•в) Осаждение ферментов полимерами

•г) Осаждение путём избирательной денатурации

•5. Разделение и очистка методом адсорбции

•6. кристаллизация и перекристаллизация