Методические аспекты определения гликированного гемоглобина

Существует несколько методов определения гликированного гемоглобина, используемых для клинических целей (таблица 25).

Таблица 25

Аналитические методы для определения гликированного гемоглобина
Метод	Принцип метода	Выявляемые фракции	Объем крови	Время анализа	Комментарии
Колоночная хроматография (макроколонка)	Ионообменная хроматография	HbA1a, HbA1b, HbA1c	100 мкл	8 – 18 ч	Лабильный HbA1c определяется частично, интерференция с HbF, HbS
Микроколонки	Ионообменная хроматография	HbA1a	100 мкл	20 мин	Интерференция с вариантами Hb, метод чувствителен к колебаниям температуры и рН
ВЭЖХ (HPLC)	Ионообменная хроматография	HbA1a, HbA1b, HbA1c	10–400 мкл	3,3-8 мин	Интерференция с вариантами Hb, метод чувствителен к колебаниям температуры и рН
Тиобарбитуровая кислота	Гидролиз и колориметрия кетогексоз	HbA1	2-4 мл	8 ч	Определяются только кетоамины, реагируют сиаловые кислоты, результат в мкмоль/моль Hb
Электрофорез	Электрофорез в геле агарозы	HbA1	20 мкл	35 мин
Изоэлектрическое фокусирование	Градиент рН 5 – 6,5	HbA1c	10 мкл	1 ч	Определяются одновременно изоформы Hb
Аффинная хроматография	Фенилборонатная колонка	Общий гликогемоглобин	150 мкл	До 20 проб/ч	Результаты, как правило, выше, чем при других методах
Иммунохимические методы	Моноклональные антитела, иммунотурбидиметрия	HbA1c	10-50 мкл	До 250 проб/ч	Возможно определение HbA2, HbS1c

Катионообменная хроматография определяет гликирование, как исчезновение положительного заряда на поверхности молекулы гемоглобина. Со слабого катионообменника при увеличении ионной концентрации и/или повышении рН гликогемоглобины элюируются перед негликированными гемоглобинами. Поэтому гликогемоглобины получили терминологию «быстрые гемоглобины». Катионообменная хроматография проводится в микро- мини- и макроколоночных вариантах и как часть высокоэффективной хроматографии. Пик HbA_1c при катионной хроматографии негомогенен и содержит некоторое количество вариантных форм негликозилированных гемоглобинов. Улучшить разделение возможно при использовании специальных материалов (поли-CATA), однако это метод не для клинических лабораторий. Этот метод можно использоват для референтных лабораторий. Все катионообменные хроматографические методы очень чувствительны к колебаниям температуры и рН.

Электрофорез. Изменение поверхностного заряда молекулы гликированных гемоглобинов используется для электрофоретического разделения на геле агарозы и для изоэлектрического фокусирования в геле с градиентом рН 5,0 – 6,5. В геле агарозы практически невозможно разделить подфракции гликозилированного Hb, но это можно сделать с помощью изоэлектрического фокусирования на геле агарозы. В настоящее время разработана технология автоматизированного проведения электрофореза гликированного Hb, это, в частности, решено фирмой Sebia (Франция).

Рис. 24. Электрофореграмма с разделением фракций гликированного гемоглобина на геле агарозы.

Иммунохимические методы. Аминокислота валин, гликированная D-глюкозой на N- терминальном конце цепи, оказалась структурным эпитопом, который легко распознается антителами. Основываясь на этом, разработаны радиоиммунные и иммуноферментные методы с использованием моноклональных или поликлональных антител. При этом отсутствует интерференция с аномальными формами гемоглобина.

Фирмой Thermo Clinical Labsystems для биохимических анализаторов семейства Konelab разработан тест-набор для определения HbA_1c, основанный на методе турбидиметрии. Последовательность процедур включает:

• Гемолиз образца крови

• HbA_1c + специфические антитела = растворимый комплекс антиген-антитело + избыток антител

• Избыток антител anti-HbA1c + полигаптен = нерастворимый комплекс

• Турбидиметрическая детекция нерастворимого комплекса

• Общий гемоглобин + Фосфатный буфер = нерастворимый комплекс

• Колориметрическая детекция

• Автоматический расчет HbA_1c, в % и в г/л

• HbA_1c% = 0,82 х (HbA_1c (г/л) х 100)/ Hb(г/л) + 2,76

В состав набора входят: гемолизирующий реагент, калибраторы, контрольные материалы (нормальный и патологический уровень). Исследование проводится на венозной или капиллярной крови. Внутрисерийная и межсирийная вариация теста не превышает 8 %.

Существенным при определении гликогемоглобина является проблема стандартизации. До настоящего времени не разработан референтный метод и нет стандартного образца для гликогемоглобина. Поэтому при проведении контроля качества нет единого контрольного материала, в многочисленных системах внешнего контроля качества используются метод- и/или производитель-зависимые контрольные материалы.