Методические аспекты определения углеводов
Определение глюкозы - один из наиболее распространенных тестов в КДЛ (до 15 % от общего числа исследований). Существует несколько методических подходов к исследованию глюкозы.
Методы «мокрой» химии.
Методы, основанные на определении восстанавливающих свойств глюкозы. Глюкоза является основным восстановителем в крови, ее удельный вклад в восстанавливающие свойства крови составляет около 80 %. В основе этих методов лежит положение, что на основе восстанавливающих свойств можно судить о содержании глюкозы в биологической пробе. Так как реально не только глюкоза биопроб обладает восстанавливающими свойствами, к тому же интерферирующие вещества наиболее активно появляются в критических ситуациях, то метод не удовлетворяет современным критериям правильности. Поэтому в настоящее время от этих методов практически повсеместно отказались. Только в некоторых лабораториях еще проводят качественную реакцию на глюкозу в моче с реактивом Гайнеса.
Колориметрические методы. Они основаны на способности глюкозы образовывать цветной комплекс с различными соединениями. Наиболее распространенным в недалеком прошлом был ортотолуидиновый метод, в котором глюкоза образует с орто-толуидином в кислой среде при нагревании продукт сине-зеленой окраски. Основные недостатки метода связаны с методическими неудобствами, низкой специфичностью, а также аллергизацией персонала и появившимися сообщениями о канцерогенном эффекте ортотолуидина.
Энзиматические методы. В КДЛ в основном используют 2 метода - глюкозоксидазный и гексокиназный.
Глюкозоксидазный метод основан на окислении глюкозы кислородом в присутствии фермента глюкозоксидазы, образуется перекись водорода, которая в присутствии пероксидазы окисляет хромоген, при этом скорость изменения оптической плотности раствора пропорциональна количеству глюкозы в биопробе.
глюкозоксидаза
Г
люкоза
+ О2
глюколактон +
Н2О2
пероксидаза
Н 2О2 + восстановленный хромоген Н2О + окисленный хромоген
Наиболее распространенным является метод Триндера, в котором в качестве хромогена используется 4-аминофеназон с фенолом или замещающими его соединениями.
Определение глюкозы глюкозоксидазным методом можно проводить в любой биологической жидкости, на фотометре с термостатированием и регистрацией кинетики изменения оптической плотности пробы или на биохимическом анализаторе. Антикоагулянты гепарин, ЭДТА, оксалат натрия, цитрат, стабилизаторы фторид и монойодацетат практически не влияют на результаты. Недостатком метода является то, что перекись водорода, образующаяся в этой реакции, может окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом доля Н2О2, окисляющая хромоген, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе.
Гексокиназный метод основан на 2 сопряженных реакциях:
Реакция регистрируется при 340 нм по образованию НАДФН (тест Варбурга). Этот метод высокоспецифичен и не дает реакций с другими компонентами сыворотки или крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы.
Экспресс-методы с использованием диагностических тест-полосок («сухая химия»)
Повсеместное внедрение диагностических тест-полосок для полуколичественного определения метаболитов крови и мочи позволяет проводить анализ быстро, в присутствии пациента, непосредственно в приемном отделении, в палате, в домашних условиях. Дешевизна и простота процедуры позволяют обеспечить реагентными тест-полосками массовое (диспансерное) исследование различных групп населения. Все виды измерений могут быть выполнены с помощью как монофункциональных, так и полифункциональных полосок с различной комбинацией реагентных зон, что дает возможность проводить как комплексные, так и отдельные исследования.
Определение глюкозы в крови с помощью тест-полосок ФАН (производство ПЛИВА- Лахема, а.с., Чешская Республика).
МЕЛЛИФАН - диагностические тест-полоски для быстрого полуколичественного определения глюкозы в крови в общей клинической практике или для самоконтроля гликемии в домашних условиях. Самоконтроль за содержанием глюкозы в крови, регулярно проводимый больными сахарным диабетом, не исключает и не заменяет постоянного медицинского контроля, однако может существенно облегчить врачу наблюдение за состоянием больного.
Принцип действия полосок МеллиФАН основан на использовании высокоспецифичных сопряженных ферментативных реакций, катализируемых глюкозоксидазой и пероксидазой. Полоски содержат 2 индикаторные зоны, различающиеся используемыми хромогенами. Первая зона индикации содержит индикатор бензидинового типа, дающий в присутствии глюкозы синее окрашивание. Вторая зона содержит хромогенную систему, которая в присутствии глюкозы дает оранжево-красное окрашивание.
Определение глюкозы в крови с помощью глюкометров. В настоящее время широко выпускаются 2 типа глюкометров для экспресс-определения глюкозы в крови - отражательные фотометры и потенциометры.
Отражательные фотометры: существует несколько поколений тест-полосок для отражательных фотометров. В основе метода лежит глюкозоксидазная реакция, в результате которой меняется цвет индикатора диагностической полоски. Измерение проводится после внесения тест-полоски в измерительную камеру, работающую на принципе отражательного фотометра. При таком способе необходимо, как правило, удалять каплю крови с полоски, заполнять полоску четко дозированной по объему каплей крови, вносить пробу в камеру прибора.
Потенциометры или амперометры - измеряют ток, возникающий в результате восстановления перекиси водорода на электрохимическом элементе. Перекись водорода образуется в ходе высокоспецифичной глюкозоксидазной реакции. Примером такого типа глюкометра является предлагаемая фирмой ПЛИВА-Лахема система СЕНЗОРИ тест - глюкометр и тест-полоски. В этом случае зона тест-полоски, на которую наносится кровь, не вводится в измерительную ячейку, капля крови наносится на полоску без дозирования, измерение глюкозы проводится по максимуму производной тока, возникающего в электрохимической ячейке при протекании глюкозоксидазной реакции. Прибор работает на принципе сенсорной технологии, прост в эксплуатации, дает надежные результаты, память прибора сохраняет 180 величин.
Многочисленные сравнительные исследования и клинические испытания свидетельствуют, что экспресс-методы определения глюкозы в крови дают достаточно надежные результаты. Тем не менее, рекомендуется использовать повторное определение глюкозы в крови методами “мокрой химии” в тех случаях, когда тесты “сухой” химии выявили снижение уровня глюкозы ниже 2,8 ммоль/л или превышение уровня 25 ммоль/л, а также при гематокрите < 25 % и > 55 %.
Определение глюкозы в моче с помощью тест-полосок ФАН (производство ПЛИВА-Лахема а.с., Чешская Республика).
ГЛЮКОФАН - диагностическая полоска для исследования глюкозы в моче. Зона индикации содержит ферменты глюкозоксидазу и пероксидазу со специальной хромогенной системой, которая в присутствии глюкозы окисляется с образованием продуктов красного цвета. Проба на глюкозу реагирует возникновением ярко оранжевой окраски на концентрацию 2ммоль/л. Концентрация 1,7 ммоль/л в первой утренней порции мочи принята за верхний предел физиологической глюкозурии. Тест является высоко специфичным для глюкозы. Присутствие других сахаров не дает положительных результатов.
Тест-зоны полосок для специальных исследований у больных сахарным диабетом.
Кетоновые тела (ацетоуксусная кислота и ацетон) в моче определяются с помощью полосок КетоФАН или полифункциональных полосок ФАН. Обнаружение кетоновых тел в моче позволяет диагностировать метаболическую декомпенсацию у больных диабетом. Кома и предкоматозное состояние практически всегда сопровождаются кетоацидозом и кетонурией (за исключением гиперосмолярной комы). У пациентов с нераспознанным сахарным диабетом I типа кетоацидоз может развиться внезапно. Если больной получает недостаточные дозы инсулина, кетоацидоз постепенно прогрессирует.
Белок в моче определяют с помощью полосок АльбуФАН или полифункциональных полосок ФАН. Тест высокочувствителен к альбумину, мало к другим белкам. Наличие белка в моче частый, но неспецифический симптом при почечных заболеваниях. У пациентов с сахарным диабетом и гипертензией часто развивается манифестная протеинурия, которая без соответствующего лечения прогрессирует в почечную недостаточность. Тест, в первую очередь, направлен на выявление нарушений клубочковой фильтрации и не идентифицирует нарушение тубулярной реабсорбции. Для исследования рекомендуется использовать первую утреннюю порцию мочи.
Аскорбиновая кислота в моче определяется с помощью полосок ДекаФАН аско. Она является сильным восстановителем. Реакция полосок специфична не только для аскорбиновой кислоты, но и для сильно восстанавливающих веществ в моче, в частности, для метаболитов аспирина. Положительная реакция этой тест-зоны должна настораживать врача по поводу результатов исследования глюкозы, так как большое количество восстанавливающих веществ способно уменьшить окрашивание тест зоны на глюкозу, поэтому исследование необходимо повторить через 2-3 дня после последнего приема витамина С, салицилатов
Удельный вес мочи зависит не только от потребления жидкости, но и от развития патологии почек, в частности диабетической нефропатии. В норме у здоровых людей удельный вес мочи может колебаться от 1,000 до 1,040 г/л. Выраженное снижение удельного веса мочи из-за нарушения концентрирующей способности почек может развиться при диабетической нефропатии. Для получения информации о концентрирующей сособности почек нужно исследовать первую порцию утренней мочи, в которой удельный вес должен быть > 1.020 г/л. При этом важно, чтобы пациент соблюдал ограничение в потреблении жидкости накануне.
Нитриты – тест, свидетельствующий о наличии в моче нитрит-образующих бактерий. У больных моча из-за присутствия в ней глюкозы является хорошей средой для бактериальной флоры, поэтому сахарный диабет является группой высокого риска по развитию асимптоматических инфекций мочевыводящих путей и хронического пиелонефрита. Даже после завершения лечения инфекции мочевыводящих путей периодические исследования необходимо продолжать с целью своевременного обнаружения рецидива. Проведение теста и оценка результатов могут проводиться пациентами самостоятельно.
Лейкоцитурия – повышенная экскреция лейкоцитов с мочой – показатель воспаления почек и/или мочевывдящих путей. При хроническом воспалении и при лечении лейкоцитурия – более надежный симптом, чем нитритный тест на бактериурию.
Полифункциональные тест-полоски ФАН для исследования мочи (производство ПЛИВА-Лахема,а.с., Чешская республика).
Полифункциональные полоски предназначены для рационализации и ускорения исследования мочи, с их помощью при одном погружении в мочу могут быть получены 2 - 10 показателей биохимических параметров мочи. В полосках зоны индикации подобраны так, чтобы полоски служили для выявления определенного типа функциональных нарушений и заболеваний.
полоски служили для выявления определенного типа функциональных нарушений и заболеваний.
ДИАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы и кетоновых тел. Полоски специально предназначены для массового обследования населения с целью выявления сахарного диабета.
ТРИФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка и кислотности (рН);
ТЕТРАФАН ДИА - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов и рН;
НЕФРОФАН ЛЕЙКО – диагностические полоски для исследования нитритов, рН, белка, лейкоцитов, крови;
ПЕНТАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови и рН;
ГЕКСАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, уробилиногена и рН;
ГЕПТАФАН - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, билирубина, уробилиногена и рН;
ОКТАФАН – диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, рН, билирубина, уробилиногена, лейкоцитов;
НОНАФАН СГ - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН и удельного веса ;
ДЕКАФАН ЛЕЙКО – диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН, удельного веса, лейкоцитов;
ДЕКАФАН АСКО - диагностические полоски для исследования глюкозы, белка, кетонов, крови, нитритов, билирубина, уробилиногена, рН, удельного веса, аскорбиновой кислоты.
Дополнительные лабораторные методы в диагностике и контроле сахарного диабета.
Внутривенный тест толерантности к глюкозе (ВТТГ).
Внутривенный глюкозотолерантный тест применяется менее широко, чем пероральный, но имеет преимущества у лиц, нагрузка глюкозой у которых вызывает тошноту, или они страдают заболеваниями ЖКТ с нарушением всасывания (синдром мальабсорбции) или после гастроэктомии. ВТТГ хорошо воспроизводим при точной дозировке глюкозы, в тоже время он относительно менее выраженный стимулятор секреции инсулина из-за отсутствия рефлекторного раздражения и выделения энтерогормонов, что имеет место при пероральном ТТГ.
Кортизон (преднизолон) глюкозотолерантный тест (КПТГ) .
Тест способствует выявлению скрытых нарушений углеводного обмена вследствие стимуляции кортизоном (преднизолоном) процессов глюконеогенеза и подавления гликогенеза, что в сочетании с нагрузкой глюкозой приводит к более значительному повышению уровня глюкозы в крови в условиях функциональной неполноценности клеточного аппарата поджелудочной железы. Показанием для проведения КПТГ служат сомнительные данные стандартного ТТГ и наличие наследственной предрасположенности к сахарному диабету.
Внутривенный толбутамидный тест.
Толбутамид - гипогликемический препарат, принимаемый внутрь, стимулирующий продукцию инсулина поджелудочной железой. Он может быть использован для оценки возможности продукции инсулина поджелудочной железой. Тест полезен для дифференциальной диагностики опухолей поджелудочной железы и функциональной гипогликемии при нормальной сахарной кривой. Тест противопоказан при базальном уровне гликемии менее 3,33 ммоль/л или при подозрении на инсулиному.
Инсулиновый тест.
После ночного голодания внутривенно вводят 0,05 - 0,15 Ед инсулина/кг. Исследуют характер снижения уровня глюкозы во времени. Этот тест используется для оценки гипофизарного резерва СТГ и АКТГ, для диагностики пониженной чувствительности к инсулину (сахарный диабет, акромегалия, синдром Кушинга) и повышенной чувствительности (пангипопитуитаризм). Для достижения эффективного результата требуются очевидные признаки гипогликемии (пот, тремор). Врач обязан присутствовать во время теста.
Определение иммунореактивного инсулина (ИРИ).
Исследование ИРИ позволяет судить о секреции эндогенного инсулина только у больных, не получающих препаратов инсулина и не получавших их ранее, поскольку к экзогенному инсулину (особенно бычьему) образуются антитела, искажающие результаты исследования. С клинической точки зрения определение инсулина имеет небольшое значение, за исключением диагностики гипогликемии натощак. Соответственно, гипогликемия натощак в сочетании с неоправданно высокой концентрацией инсулина в сыворотке является убедительным аргументом в пользу предположения о наличии инсулиномы. Исследование инсулина не включено в диагностические критерии сахарного диабета, содержание инсулина может варьировать от низкого (СД I типа) до высокого (СД II типа) уровня.
Определение С-пептида.
С-пептид является показателем синтетической способности клеток поджелудочной железы, он образуется в эквимолярных количествах с инсулином из проинсулина. Однако время полувыведения С-пептида из кровотока 30 – 40 мин, что на порядок дольше, чем у инсулина. Определение С-пептида полезно для наблюдения за больными после панкреоэктомии, при пересадке поджелудочной железы, позволяет оценить уровень эндогенного инсулина в присутствии (при введении) экзогенного инсулина или при наличии к инсулину антител, что наблюдается у больных манифестным сахарным диабетом. Определение С-пептида применяется для оценки степени гипогликемии при подборе дозы инсулина для инъекции и для подтверждения ремиссии сахарного диабета. Повышается С-пептид при инсулиноме, введении пероральных гипогликемических средств, почечной недостаточности (выводится через почки), сахарном диабете II типа.
Измеряется С-пептид радиоиммунным методом, возможна перекрестная реакция с проинсулином.
Определение проинсулина.
У здоровых людей примерно 3% проинсулина не превращается в инсулин, а выходит в кровоток в неизменном виде. Его концентрация в сыворотке после 12 ч голодания менее 25 нг/л. Повышение концентрации проинсулина набюдается при инсулиноме, при СД 2 типа и при сахарном диабете MODY-типа. Повышение проинсулина в сыворотке вероятно можно интерпретировать как показатель избыточной стимуляции клеток. Время полувыведения проинсулина из системы циркуляции около 17 мин, что существенно больше, чем у инсулина (4 мин), поэтому концентрация в сыворотке проинсулина в норме может составлять до 10 % от концентрации инсулина.
Определение глюкагона.
Глюкагон - гормон, синтезируемый клетками островков поджелудочной железы. Гипогликемическая стимуляция выброса глюкагона отсутствует у больных СД I типа. Дефицит глюкагона может отражать общее снижение массы островков при панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.