10. Культивування фітопатогенних вірусів.

Для культивування фітопатогенних віру­сів використовують сприйнятливі до них рослини, які вирощують у природних умовах або в теплицях і оранжереях.

Рослина, у якій культивують вірус, має бути:

1. Придатною для нагромадження вірусу у великій кількості.

2. Стійкою проти зараження іншими близькоспорідненими вірусами.

3. Не містити речовин, які здатні інактивувати або осаджувати вірус в екст­ракті.

4. Стійкою до інсектофунгіцидів.

Стійкою до бактерійних і грибкових захворювань. вірусів найчастіше використовують молоді рослини, які добре ростуть, не мають будь-яких патологічних ознак і не містять у своїх клітинах високих концентрацій фенолів, рибонуклеази тощо, а також можуть інгібувати або незворотно осаджувати віруси. Такими рослина­ми, наприклад, можуть бути тютюн сорту Самсун, для культивування вірусу тютюнової мозаїки, дурман для вирощування Х-вірусу картоплі. Тепер описа­на велика кількість рослин-індикаторів з різних родів і родин, які застосовують для культивування вірусів.

Рослини-індикатори, умови, за яких їх вирощують, і час, коли рослини мож­на використовувати для виділення вірусів, треба вибирати так, щоб вихідна концентрація вірусних часток була якомога вищою. За даними Р. Метьюза, концентрація багатьох вірусів досягає максимуму через кілька днів або тижнів після інфікування, а потім дуже швидко знижується.

11. Методи кількісного визначення вірусів.

Основним методом визначення кількості вірусів є встановлення в досліджува­ному середовищі титру вірусів, а саме їхньої кількості в розчині - інфекційних одиниць. Останні визначають найменшу кількість вірусу, здатну викликати інфек­цію. Для їх визначення використовують два методи. Перший полягає у визначенні 50% летальної дози. Другий метод дає змогу встановити чис­ло інфекційних одиниць за числом бляшок, які утворилися у культурі клітин.

У разі визначення величини LD₅₀ - досліджуваний вірусний матеріал розво­дять у розчині, інфікують групу тварин (10 індивідуумів) або культуру клітин у пробірках. Потім спостерігають загибель тварин або зміни, що відбуваються у культурі під впливом вірусу. Статистичним методом визначають концентра­цію, що здатна умертвити 50% тварин із числа заражених вихідним матеріалом. При використанні культури клітин необхідно знайти таку дозу вірусу, яка має згубну дію на 50% інфікованих нею клітин.

Методом бляшок неможливо отримати статистичні дані, але можна встано­вити фактичне число одиниць вірусу в матеріалі, які утворюють бляшки в куль­турі клітин. Для ідеального випадку така одиниця відповідає одній функціо­нально повноцінній частці.

Кількісне визначення вірусної активності названо титруванням. Титр вихідної вірусної суспензії виражають числом інфекційних одиниць, які припа­дають на одиницю об ’єму.

Найбільш точним методом визначення титру бактеріофага є метод підрахунку стерильних бляшок. Число бляшок, які утворюються в результаті інкубації на суціль­ному шарі бактерій, прямо пропорційне кількості внесеного фага. Т = , де n-число бляшок; V-об’єм суспензії фага, х – розведення суспензії. Віруси рослин, титрують шляхом підрахунку числа не­кротичних плям чи інших уражень, що з’являються на листках хворих рослин. Великий крок вперед був зроблений після введення у практику методу од­ношарових культур клітин, які ростуть in vitro. Цитопатичні віруси, тобто віру­си, що спричиняють деструкцію клітин, утворюють на клітинних культурах бляшки, число яких відповідає кількості вірусу, використаного для зараження. Аналогічно титрують онкогенні віруси, що утворюють зони проліферації. Тут титр вірусу визначають за числом одиниць, які утворюють вогнище ураження.