Хід роботи

Для визначення амоніфікуючих бактерій, що розкладають білкові речовини з утворенням аміаку й сірководню проводять посів ґрунтової суспензії в мясо-пептонний бульйон.

1. Приготувати ґрунтову суспензію (1 : 10 чи 1 : 100 ).

2. Бактеріологічною петлею взяти над полум'ям пальника краплю ґрунтової суспензії і перенести в пробірку з МПБ.

3. Пробірку закрити ватним корком і підвісити під ним індикаторні папірці: для виявлення аміаку — червоний лакмус, для визначення сірководню - папірець, просочений оцтовокислим свинцем (папірці повинні вільно звішуватися в пробірці, не торкаючись її стінок і середовища).

4. Пробірки щільно закрити зверху пергаментом, целофаном або гумовим ковпачком для утруднення виходу газоподібних продуктів.

5. Помістити в термостат з температурою 25—30°С.

6. Спостереження за зміною середовища проводити через 1; 3; 5 і 7 днів після посіву.

При наявності в досліджуваному ґрунті амоніфікуючих мікроорганізмів середовище протягом першої ж доби каламутніє і з пробірки виділяються гази, що неприємно пахнуть. При розкладанні білкових речовин з утворенням аміаку вкладений в пробірку червоний лакмусовий папірець синіє.

Сірководень, що виділяється при розкладанні сіркомістких амінокислот (цистин, цистеін, метіонін) визначають за потемнінням смужки фільтрувального папірця, просоченого основним розчином оцтовокислого свинцю. Останній, зв'язуючись із сірководнем, переходить у сірчистий свинець, що має чорний колір.

Питання для самоперевірки

1. Що називаеться амоніфікацією ?

2. Що відбувається з продуктами проміжного розпаду амінокислот в аеробних і анаеробних умовах?

3. Від чого залежать швидкість мінералізації білка і нагромадження аміаку ?

4. Які аеробні мікроорганізми є найбільш активними учасниками розкладу білка?

5. Які факультативні анаеробні мікроорганізми є найбільш активними учасниками розкладання білка?

6. Які анаеробні мікроорганізми є найбільш активними учасниками розкладання білка?

Лабораторна робота №7 Вивчення денітрифікуючих бактерій

Мета роботи: дослідити ґрунтові зразки на наявність денітрифікуючих організмів в ґрунті методом накопичувальної культури.

Теоретична частина

Денітрифікацією називають процес відновлення нітратів через стадію нітритів до аміаку і вільного молекулярного азоту. Розрізняють пряму і непряму денітрифікацію. При прямій денітрифікації відновлення нітратів здійснюється в результаті життєдіяльності особливої групи так званих денітрифікуючих бактерій. Процес прямого відновлення нітратів денітрифікуючими бактеріями має для них енергетичне значення - за рахунок відновлення нітратів вони окислюють органічні речовини:

5C₆H₁₂O₆ + 24KNO₃ = 24KНCO₃ + 6CO₂ + 12N₂ + 18H₂O + 1758 кдж

В аеробних умовах денітрифікуючі бактерії за звичай не відновлюють нітратів, а використовують у процесі дихання вільний кисень повітря. Таким чином, нітрати в анаеробних умовах є акцепторами водню замість кисню повітря, який виконує роль акцептора водню в аеробних умовах.

Найбільш активні наступні збудники прямої денітрифікації.

Рseudomonas denitrificans — маленькі, перетрихіально джгутикові, безспорові палички; факультативні анаероби. Відновлюють нітрити до молекулярного азоту.

Рseudomonas fluorescens — невеликі, безспорові, грамнегативні, рухливі палички, що утворюють зеленуватий пігмент і зафарбовують середовище в жовто-зелений колір. Дуже активно відновлюють нітрати з утворенням молекулярного азоту.

Achromobacter stutzeri — невеликі, грамнегативні палички (0,3х0,5 мкм), з'єднані в ланцюжки. Відновлюють нітрати в анаеробних умовах.

Рseudomonas pyoсyanea — невеликі, безспорові, грамнегативні, рухливі палички; краще розвивається в аеробних умовах, утворює пігмент, що зафарбовує середовище в синьо-зелений колір. Відновлюють нітрати до нітритів і навіть до молекулярного азоту.

Процес прямої, чи “справжньої”, денітрифікації небажаний, тому що в результаті його легкодоступні, добре засвоювані рослинами азотисті сполуки втрачають азот. Мінеральний азот переходить у газоподібну форму і не може засвоюватися рослинами. З’ясовано, що в процесі денітрифікації втрати азоту можуть досягати 20% від загальної кількості нітратів у ґрунті. Однак помилково думати, що процес денітрифікації є широко розповсюдженим. Основні умови, що сприяють денітрифікації, — висока вологість ґрунту, погана аерація, велика кількість легкоокислюваних безазотистих органічних сполук і нітритів, поганий дренаж, певна кислотність (рН 7,0—8,2) і температура.

При відсутності цих умов, навіть при наявності великої кількості денітрифікуючих бактерій у ґрунті, помітного зменшення азоту в результаті денітрифікації не спостерігається. Велика кількість денітрифікуючих бактерій у родючих ґрунтах, у ризосфері і на коренях добре розвинутих рослин за певних умов може відігравати позитивну роль. Велика маса денітрифікуючих бактерій, маючи широкий набір ферментів, може викликати спряжене протікання процесів амоніфікації і денітрифікації. Денітрифікуючі бактерії здатні не тільки відновлювати нітрати. Роль їх у біологічному кругообігу речовин у природі дуже різноманітна.

Непряма денітрифікація відбувається в результаті чисто хімічної взаємодії між амінокислотами, амінними й амідними сполуками та азотистою кислотою. У результаті цієї взаємодії також утворюється молекулярний азот.

Роль мікроорганізмів у цьому процесі зводиться до утворення нітритів і амінокислот. Тому непрямій денітрифікації сприяють багато видів усіляких бактерій, що відновлюють нітрати до нітритів або розкладають білкові речовини з утворенням амінокислот і їхніх амідів.

Обладнання і матеріали: поживне середовище Гільтая в круглих колбах з вузьким горлом, ґрунт, шпатель для внесення ґрунту.