Міністерство освіти і науки України

Український національний університет водного господарства та природокористування

Кафедра агрохімії, грунтознавства та землеробства

082- 159

Методичні вказівки

до виконання лабораторних робіт з дисципліни

“Мікробіологія з основами вірусології ”

студентами спеціальності 6. 090101 “Агрохімія і грунтознавство”

денної форми навчання

Затверджено на засіданні

методичної комісії

напряму «Агрономія»

Протокол №

від 2009 р.

Рівне 2009

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з дисципліни “Мікробіологія з основами вірусології” студентами спеціальності 6.090101 “Агрохімія і грунтознавство” денної форми навчання .— Рівне: НУВГП, 2009. — 24 с.

Упорядники: М.С. Мандигра, професор, А.В. Кучерова, старший викладач.

Відповідальний за випуск С. І. Веремеєнко, д-р с.-г. наук, проф., завідувач кафедри агрохімії, грунтознавства та землеробства.

З М І С Т

1	Прилади та устаткування для мікробіологічних досліджень	3
2	Будова мікроскопа	5
3	Методи виділення і культивування мікроорганізмів	7
4	Вивчення колоній і техніка виділення чистих культур мікроорганізмів	10
5	Вивчення вільноживучих азотфіксаторів	12
6	Вивчення амоніфікуючих бактерій	14
7	Вивчення денітрифікуючих бактерій	17
8	Вивчення нітрифікуючих бактерій	18
9	Вивчення фосфоромінералізуючих бактерій	21
10	Облік ризосферної і кореневої мікрофлори методом послідовних відмивань за О.З.Теппер	23
	Література	24

Лабораторна робота №1 Прилади та устаткування для мікробіологічних досліджень

Мета роботи: ознайомитися з приміщенням навчальної мікробіологічної лабораторії та оснащенням робочого місця, з охороною праці і технікою безпеки при проведенні мікробіологічних досліджень. Вивчити методи і послідовність роботи при стерилізації поживних середовищ, лабораторного посуду та інших матеріалів.

Теоретична частина

Мікробіологічна лабораторія повинна бути оснащена необхідними меблями: лабораторними столами, стільцями або гвинтовими табуретками, шафами що закриваються, для збереження посуду, поживних середовищ, реактивів і апаратури.

Для основного устаткування лабораторії обов'язкові термостати для вирощування мікробів, апаратура для стерилізації (автоклав, сухожарова піч Пастера, апарат Коха, водяна баня, ультратермостат), бактеріальні фільтри, центрифуги, апарат для дистиляції води, вакуумні насоси, холодильні установки для збереження музейних культур мікроорганізмів і швидкопсувних препаратів, штативи для пробірок. Емальовані каструлі, бачки, цебра й інший посуд, необхідний для варіння поживних середовищ і кип'ятіння відпрацьованого матеріалу, рН-метри, аналітичні ваги.

Крім цього, у лабораторії необхідно мати достатню кількість склопосуду й інструментів, які використовуються при мікробіологічних дослідженнях (чашки Петрі, пробірки, скельця предметні та покривні, піпетки пастеровські та градуйовані, шпателі скляні, циліндри, колби, ступки порцелянові, петлі бактеріологічні, пінцети, ножиці, скальпелі, лотки емальовані й ін.).

У мікробіологічній лабораторії повинні бути в достатній кількості сухі поживні середовища, набір хімічних компонентів, які найчастіше використовуваних для приготування поживних середовищ, набір вуглеводів, барвників і дезинфікуючих засобів (хлорамін, фенол, їдкий натр і ін.), фільтрувальний папір, імерсійна олія, спирт, ефір та інші реактиви і матеріали.

Лабораторні столи з підведеної до них електроенергією, газом і водою розміщують у лабораторії так, щоб світло від вікон падало спереду або збоку від працюючого, краще з лівої сторони. Для зручності дезінфекції поверхню лабораторних столів покривають ліноліумом, а ще краще вогне-кислотостійким пластиком. На робочому столі повинні бути: освітлювач, мікроскоп, який закривається скляним або хлорвініловим ковпаком, набір барвників і реактивів для фарбування мікробів, газовий або спиртовий пальник, штатив для пробірок, бактеріологічна петля, пастеровські та градуйовані піпетки, шпателі (у склянці), предметні та покривні скельця, ванночка з містком для фарбування мікробів, посудина з дезинфікуючою рідиною (1%-ий розчин хлораміну або 3%-ий розчин фенолу), імерсійна олія. Олівці по склу, фільтрувальний папір, бавовняна серветка, шматочок господарського мила для знежирення стекол, сірники й ін.

Методи стерилізації. Стерилізація - це повне знищення мікроорганізмів, їх спор і всього живого в поживних середовищах, матеріалі, посуді, інструментах і інших предметах лабораторного побуту.

Найбільш часто застосовується хімічна і фізична стерилізація.

Хімічна стерилізація грунтується на згубній дії хімічних речовин на мікроорганізми. Вона застосовується для обробки вакцин, сироваток і інших біопрепаратів, консервованих різними антисептиками (хлороформ, хінозол, мертіолат і ін.).

Хімічні речовини застосовуються також для знищення патогенних (хвороботворних) мікробів в об'єктах зовнішнього середовища: на робочому місці, у приміщеннях, у робочому одязі, на руках і т.п. У цих випадках говорять про дезинфекцію.

Для дезинфекції застосовують 3 - 5%-ий водяний розчин фенолу, 0,5 – 2%-ий розчин формаліну, 10%-ий розчин хлорного вапна, 0,5 – 3%-й розчин хлораміну, розчини йоду, сулеми й ін.

До фізичних методів стерилізації відносяться: стерилізація високою температурою, ультрафіолетовими променями, радіоактивними випромінюваннями, ультразвуком, холодна стерилізація фільтруванням через спеціальні бактеріальні фільтри.

Стерилізація високою температурою – один з надійних і найбільш розповсюджених фізичних методів. Вона проводиться шляхом прожарювання предметів у полум'ї пальника , кип'ятінням, сухим жаром (гарячим повітрям), перегрітою парою під тиском і текучою парою.

Прожарювання в полум'ї – швидкий і надійний метод стерилізації. Цим методом стерилізують бактеріологічні петлі, голки, пінцети, предметні скельця, пастеровські піпетки й інші дрібні інструменти.

Для стерилізації оброблюваний предмет кілька разів проводять через полум'я пальника. При прожарюванні відбувається згоряння мікробів і їх спор.

Кип'ятіння – найпростіший спосіб стерилізації голок, шприців, інструментів. Проводиться в спеціальних стерилізаторах протягом 10 – 15 хв. Додавання до води 1 – 2% соди значно підвищує стерилізуючу дію кип'ятіння і усуває твердість води, що охороняє металеві предмети від іржі після кип'ятіння. Цей метод не забезпечує повної стерилізації, тому що спори деяких бацил і клостридій витримують кип'ятіння протягом декількох годин.

Стерилізація сухим жаром або гарячим повітрям проводиться в спеціальних печах Пастера або сухожарових шафах. Стерилізують сухим жаром вату, марлю, пробірки, пастеровські та градуйовані піпетки, колби, чашки Петрі й інший скляний посуд. Перед стерилізацією посуд добре миють, висушують, закривають пробірки і колби ватяними корками, а піпетки загортають у папір. Стерилізація проводиться при 160 – 170⁰С протягом 1,5 години з моменту досягнення цієї температури. Показником достатньої стерилізації є легке пожовтіння паперу, у який загорнені предмети, що стерилізуються.

Стерилізація парою під тиском – найефективніший у бактеріологічній практиці спосіб стерилізації. Навіть однократна стерилізація парою під тиском знищує не тільки вегетативні, але і спорові форми бактерій. Стерилізацію парою під тиском проводять у спеціальних приладах – автоклавах.

Стерилізація в автоклаві проводиться, як правило, при 1 атм (понад нормального атмосферного), що відповідає 120,6⁰С, або при 1,5 атм, що відповідає 126⁰С.

Тривалість стерилізації залежить від складу об'єкту, що стерилізється і ступеня його бактеріального забруднення та коливається від 30 хвилин до 1 – 1,5 годин. Стерилізують в автоклаві поживні середовища, лабораторний посуд, відпрацьовані культури.

Устаткування і матеріали: автоклав, сушильна шафа, апарат Коха, електричний стерилізатор, чашки Петрі, колби, металеві петлі, вата, папір для загортання скляного посуду, сода, штатив із пробірками, пастеровскі піпетки, пінцет, скальпель, посудина з дезинфікуючим розчином, лоток з містком для фарбування препаратів, набір барвників, предметні та покривні скельця, мило, сірники, серветки бавовняні, фільтрувальний папір, поживні середовища.