37. Рекомбинантты белоктарды эукариот жүйесінде алу артықшылықтары.

Эукариот жүйесіне тән кДНК негізінде рекомбинантты белоктар алу үшін прокариоттық клеткалар жүйесі пайдаланылады. Алайда, кей жағдайларда бактерия клеткаларында синтезделген эукариоттық белоктар құрылымы тұрақсыз және биологиялық белсенділігі болмайды. Сонымен қатар соңғы өнімді қаншалықты тазалағанмен де оның құрамы бөгде токсинді заттармен немесе адам мен жануарлар организмінде дене температурасының жоғарылауына әкелетін қосылыстар пирогендер болуы мүмкін. Бұл келеңсіздіктерді жеңу үшін, медициналық салада пайдаланылатын тазалығы жоғары рекомбинантты белоктар алу мақсатында эукариоттық экспрессия жүйесі жасалған. Мұндай эукариоттық жүйелермен синтезделген белоктар өзінің биохимиялық, физикалық және функционалдық қасиеттері жағынан табиғи белоктарға жақын болуы керек. Прокариот клеткалары аутенттік белок варианттарының синтездей алмауы, оларда спецификалық посттрансляциялық модификацияларды енгізудің адекватты механизмдерінің болмауымен түсіндіріледі.

Эукариот клеткалар жүйеісінде белоктар келесі посттрансляциялық өзгерістерден өтеді:

• Дисульфидтік байланыстың түзілуі. Бұл реакцияны дисульфидизомераза деп аталатын фермент катализдейді. Құрылымы дұрыс түзілмеген белок тұрақсыз болып келеді, сондай-ақ мұндай белоктардың активтілігі болмайды.

• Протеолитикалық ыдырау. Полипептидтік тізбектің арнайы участогын (сигналдық пептидтер) кесіп тастау, нәтижесінде функционалды белсенді белок түзіледі.

• Гликозилдену: посттрансляциялық модификациялардың ішіндегі ең маңыздысы болып табылады. Гликозилдену нәтижесінде белокта термотұрақтылық қасиеті, ал кейбір жағдайда – ерекше қасиеттері пайда болады. Гликозилдену реакциясының ең кең таралған түрлері спецификалық қант қалдықтарының серинге немесе треонинге келіп қосылуы – О-гликозилдену және аспарагинге қосылуы N-гликозилдену.

• Белок құрамындағы аминқышқылдарының модификациясы: фосфорлану, ацетилдену, ацилдену, гамма-карбоксилдену, сульфаттану, миристилдену және пальмитоилдену.

Жоғарыда көрсетілген посттрансляциялық модификациялардың ішінде прокариоттық қожайын клеткалар соңғы екеуін: гликозилдену мен белок құрамына кіретін амин қышқылдарының модификациясын дұрыс жүргізе алмайды.

Эукариоттық экспрессиялаушы векторлар құрылысы прокариоттық аналогтарына ұқсас болып келеді, оның құрамында:

• Эукариоттық селективті маркер;

• Эукариоттық промотор;

• Эукариот жүйесіне тән транскрипция мен трансляция терминациясының сайттары;

• мРНК-ның полиаденилдену сигналы болу керек.

Ашытқы жүйесіне гендерді трансформациялаудың 3 әдісі қолданылады. Бірінші әдісте, экзогенді ДНК молекуласын алдын ала химиялық немесе энзимологиялық жолмен клетка қабықшаларынан ажыратылған ашытқы клеткаларына (протопласттарға) тікелей қосады. Келесі бір әдісте клеткаларға бөгде ДНК молекуласын енгізбес бұрын алдын ала литий ацетатымен өңдейді немесе электропорация әдісін қолданады.

Жануарлар клеткаларына рекомбинантты ДНК молекуласын енгізу үшін клеткаларды тұндырылған кальций фосфатымен немесе ДЕАЕ-декстранмен инкубациялайды, немесе электропорация әдісін қолданады. Кейбір жағдайларда, мысалы, трансгенді жануарлар алу мақсатында ретровирустық векторларды қолдану мүмкін.

Клондалған эукариоттық гендердің экспрессиялануын қамтамасыз ету үшін кәдімгі ашытқы Saccharomyces cerevisiae клеткаларын қолданады. Ол үшін бірнеше себеп бар:

Біріншіден, Saccharomyces cerevisiae бір клеткалы организм, оның генетикасы, физиологиясы жақсы зерттелген, сондай-ақ бұларды кішігірім зертханалық колбаларда, сонымен қатар үлкен өндірістік биореакторларда өсіруге болады.

Екіншіден, бұл ашытқы клеткаларынан бірнеше өте мықты промоторлар бөлініп алынған және сипаттамалары берілген. Эндогендік экспрессиялаушы вектор ретінде ашытқы клеткаларына тән табиғи 2 мкм плазмидаларды қолдануға болады.

Үшіншіден, S. сerevisiae клеткасында эукариоттық жүйелерге тән барлық посттрансляциялық модификациялар жүреді.

Төртіншіден, S. сerevisiae клеткалары синтезделген белоктарды ортаға секрециялау қабілетіне ие, белок клеткадан ортаға бөлінгендіктен соңғы өнімді тазалау қиынға соқпайды.

Бесіншіден, Saccharomyces cerevisiae ашытқысын адамзат баласы ерте кезден бастап көптеген тұрмыстық салаларда: атап айтсақ, сыра кайнату, шарап ашыту, наубайханада нан пісіру және т.б. пайдаланып келетіндіктен, АҚШ-тың тағам өнімдері, медикаменттер мен косметикалық құралдарды бақылау департаменті Saccharomyces cerevisiae ашытқысын «қауіпсіз организмдер» (GRAS, generally recognized as safe) қатарына жатқызған. Бұл ашытқы жүйелерінің көмегімен синтезделген белоктар медицинада еш қосымша тексеруді талап етпестен қолданыла беруге болады. S. сerevisiae синтездеген кейбір белоктар вакциналық және фармацевтикалық препараттар ретінде, диагностикалық мақсатта қолданылуда.