Занятие №4. Тема: бактериологический метод исследования. Культивирование микроорганизмов.

1. Значение метода.

2. Питательные среды и методы стерилизации.

3. Техника посева микроорганизмов на питательные среды. Культивирование микроорганизмов.

4. Культивирование аэробов.

5. Культивирование анаэробов.

1. Значение метода.

Культуральный (бактериологический, вирусологический, микологический, протозоологический методы).

Заключается в выделении чистой культуры возбудителя и её исследовании.

Бактериологический (культуральный) метод является основным, самым точным методом диагностики бактериальных инфекций. Его используют почти при всех заболеваниях. Это «золотой стандарт» микробиологической диагностики.

Диагностическая ценность: это самый ценный метод («золотой стандарт»). Этот метод позволяет выделять и идентифицировать микроб-возбудитель, т. е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, т. к. они имеют дело с изменениями в организме, обусловленными наличием в нем микроба.

Позволяет определить:

● факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах и их количество;

● особенности роста на различных питательных средах;

● культуральные свойства (форма, размер, цвет колоний);

● биохимические свойства;

● антигенную структуру;

● токсинообразование.

Достоинства метода: ● возможно определить вид микроба, вызвавшего болезнь; ● можно определить многие особенности возбудителя.

Недостатки метода: ● длительность исследования (от 4-5 дней до 2 месяцев); ● опасность (т. к. накапливается чистая культура возбудителя); ● сравнительная дороговизна (дорогие питательные среды и др.).

2. Питательные среды и методы стерилизации.

Питательные среды – это среды того или иного состава, предназначенные для культивирования микробов (бактерий, микроскопических грибков и простейших) в лабораторных и промышленных условиях.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

1. Стерильность. Питательные среды не должны содержать в себе постороннюю микрофлору. Все питательные среды должны быть стерильны, что обеспечивает получение чистых микробных культур.

2. Питательность. Должны содержать питательные вещества, необходимые данным бактериям.

3. Влажность. Должны быть влажными, так как питание осуществляется путем осмоса и диффузии через всю поверхность бактериальной клетки. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не менее 20 %.

4. Прозрачность. Должны быть прозрачными (полупрозрачными), чтобы был виден рост микробов (особенно важно для жидких сред).

5. Кислотность (оптимальный pH). Должны иметь оптимальное значение pH, так как кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий. Для большинства бактерий оптимальная кислотность: 7,2-7,6.

6. Изотоничность. Питательные среды должны содержать определенный набор солей и иметь оптимальную концентрацию NaCl для того, чтобы они были изотоничными для микробной клетки, так как осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки.

Стерилизация (sterilis – бесплодный) – это полное уничтожение вегетативных и споровых форм всех (патогенных, условно-патогенных, непатогенных) микроорганизмов.

Виды стерилизации:

1) Обжигание (прокаливание, фламбирование). Стерилизуют над пламенем спиртовки или горелки.

Применяют для: стерилизации бак. петель, пинцетов, скальпелей, предметных стекол и др.

2) Кипячение. Кипятят в стерилизаторах.

Применяют для: стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов.

3) Сухим жаром. Стерилизуют в сухожаровых шкафах или в печах Пастера.

Применяют для: стерилизации стеклянной посуды, марли, ваты и др.

4) Насыщенным паром под давлением. Стерилизуют в автоклаве.

Применяют для: стерилизации питательных сред, растворов, халатов, отработанных микробных культур, отработанного пат. материала и др.

5) Текучим паром.

Стерилизуют в аппарате Коха или в автоклаве (при незавинченной крышке и открытом выпускном кране).

Применяют для: стерилизации питательных сред, которые изменяются при температуре выше 100°С (молоко, желатина, картофельные среды и др.).

6) Пастеризация.

Пастеризация – это частичная (неполная) стерилизация. Нагревают сначала до 70-80°С в течение 5-10 минут и охлаждают до 10°С.

Применяют для: стерилизации питательных сред, растворов, молока, вина, пива (т. е. те, которые теряют свои качества под воздействием высоких температур).

3. Техника посева микроорганизмов на питательные среды. Культивирование микроорганизмов.

Посев – это внесение части исследуемого материала в стерильную питательную среду.

1. ПОСЕВ (ПЕРЕСЕВ) БАКТЕРИЙ В ПРОБИРКУ С ЖИДКОЙ СРЕДОЙ

Посев проводят бактериологической петлей или пипеткой Пастера.

При посевах в жидкие среды важно следить затем, чтобы не намочить пробку жидкой питательной средой.

Здесь приведен пример посева из скошенной плотной питательной среды (с культурой) на жидкую (стерильную).

Порядок посева (пересева) бактерий в пробирку с жидкой средой.
1. В правую руку берут бактериологическую петлю (держат как ручку).	2. В левую руку берут 2 пробирки (держат в наклонном положении): 1) пробирку с чистой культурой, выросшей на среде (ближе к себе); 2) пробирку со стерильной (незасеянной) жидкой средой (дальше от себя).			3. Прокаливают бактериологическую петлю (докрасна) и петледержатель в пламене горелки (т. к. они при посеве входят в пробирку).
4. Захватывают ватные пробки (мизинцем правой руки) вынимают и держат их во время посева в таком положении (класть пробки на стол нельзя). Обжигают края открытых пробирок в пламени горелки.		5. Вводят стерильную бактериологическую петлю в пробирку с культурой. Петлю охлаждают о внутреннюю стенку пробирки. Прикасаются к участку незасеянного агара и, если он не плавится, прикасаются к поверхности культуры бактерий. Набирают немного материала. Пробирку слегка отодвигают от пламени (предохраняя материал от сжигания). Быстро, но осторожно переносят петлю в пробирку со стерильной жидкой средой.
6. Петлю с микробным материалом опускают в пробирку и тщательно растирают по стенке пробирки у верхнего края жидкой среды, все время смывая его средой (если культура взята петлей из плотной среды). Или петлю с микробным материалом опускают непосредственно в стерильную среду и ополаскивают (если культура взята петлей из жидкой среды). Извлекают петлю.			7. Обжигают края пробирок. Обжигают пробки, закрывают ими пробирки.		8. Прокаливают бактериологическую петлю (докрасна) и петледержатель в пламене горелки.