Микробиологическое исследование

Цель исследования: обнаружение возбудителя столбняка и столбнячного токсина (практически проводят редко).

Материал для исследования

1. Содержимое раны.

2. Кусочки ткани с пораженного участка.

3. Инородные тела, попавшие в рану.

4. С профилактической целью исследуют на стерильность перевязочный материал, кетгут, шелк и препараты для подкожного введения (см. "Санитарная микробиология").

5. Почва (см. "Санитарная микробиология").

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Биологический.

3. Бактериологический (выделение возбудителя столбняка).

Ход исследования

Первый день исследования

Первый день исследования

Второй - третий дни исследования

1. Если животные не погибли, продолжают за ними наблюдение. Признаки столбняка у мышей: взъерошенная шерсть, ригидность конечностей и хвоста ("хвост трубой"), паралич лапки, в которую введен токсин. Животные погибают в характерной позе: поджав передние лапки и вытянув задние. После гибели животного производят микроскопическое и бактериологическое исследование тканей из органов.

У контрольных мышей, получивших токсин одновременно с антитоксином, заболевание столбняком не возникает.

2. При отрицательном результате биологической пробы изучают посевы. Подозрительные колонии пересевают для выделения чистой культуры на среду Китта - Тароцци.

Четвертый - пятый дни исследования

Изучают культуральные свойства выделенных микроорганизмов. Делают мазки и микроскопируют их. Полученную культуру испытывают на наличие столбнячного токсина в биологической пробе (по той же схеме, табл. 51).

Таблица 51. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства основных видов патогенных анаэробов

Контрольные вопросы

1. Опишите морфологические свойства возбудителя столбняка.

2. Каковы ферментативные свойства бацилл столбняка?

3. Токсинообразование и антигенная структура бацилл столбняка.

4. Патогенез столбняка.

5. Специфическая профилактика и лечение столбняка.

6. На каких животных и как ставят биологическую пробу?

Глава 35. Возбудители газовой гангрены

Газовая гангрена - это полимикробная инфекция, т. е. вызывается группой микроорганизмов. Они относятся к семейству Bacillaceae, роду Clostridium.

Основные представители: C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C. sordellii. Обычно заболевание возникает в результате попадания в рану одного или нескольких представителей рода Clostridium и часто в сочетании с аэробами - стафилококками и стрептококками.

Clostridium perfringens

C. perfringens открыт в 1892 г. Уэлчем и Неттолмом.

Морфология. C. perfringens - крупные полиморфные палочки в среднем 3-9 × 0,9-1,2 мкм. Неподвижны. Свежевыделенные из организма культуры имеют капсулу. При попадании в неблагоприятные условия образуют споры овальной формы, располагающиеся центрально или субтерминально. Грамположительны. Старые культуры утрачивают способность окрашиваться по Граму.

Культивирование. C. perfringens - анаэробы, но не очень чувствительны к кислороду воздуха. Они хорошо и быстро растут на питательных средах, приготовленных из гидролизатов мяса или казеина: 3-8 ч при температуре 37-42° С и рН среды 7,2-7,4. Рост сопровождается бурным газообразованием и снижением рН в кислую сторону. На плотных питательных средах C. perfringens образуют шероховатые R, гладкие S и слизистые М колонии. В некоторых условиях появляются колонии смешанного О-варианта. В глубине агара столбиком колонии имеют вид чечевичных зерен. В жидких средах рост характеризуется равномерным помутнением и газообразованием. На кровяных средах C. perfringens образуют зону гемолиза.

Ферментативные свойства - C. perfringens сбраживают лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. Протеолитические свойства - свертывают молоко, медленно (2-7 дней) разжижают желатин. Свертывают лакмусовое молоко с образованием сгустка кирпичного цвета и полного просветления молочной сыворотки. Восстанавливают нитраты в нитриты, индол не образуют.

C. perfringens продуцируют лецитиназу, гиалуронидазу, желатиназу, коллагеназу и другие ферменты патогенности.

Токсинообразование. C. perfringens выделяют сложный токсический комплекс, состоящий из нескольких токсинов, которые обозначаются греческими буквами α, θ, β и др. Кроме того, они образуют энтеротоксин. Основным токсическим комплексом является α-токсин, обладающий большой и всесторонней биологической активностью.

Антигенная структура. C. perfringens разделяют на пять сероваров, которые обозначаются большими латинскими буквами А, В, С, D и Е. Эти серовары отличаются друг от друга по антигенным и биохимическим свойствам своих токсинов.

Серовар А является обитателем кишечника в естественных условиях, но может вызвать пищевые токсикоинфекции у людей. Серовар В вызывает кишечные явления у ягнят. Серовар С вызывает некротический энтерит у людей и заболевания у крупного рогатого скота. Серовар D вызывает энтеротоксемию у животных.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы C. perfringens не очень устойчивы: на них губительно действуют дезинфицирующие вещества в обычных, применяемых в лабораториях концентрациях.

Споры некоторых штаммов выдерживают кипячение в течение нескольких минут. Наиболее устойчивы микробы серовара А.

Восприимчивость животных. В естественных условиях C. perfringens вызывают заболевания у домашних животных. Из экспериментальных животных к ним чувствительны морские свинки, кролики, голуби, мыши. У зараженных животных на месте введения токсина возникает некроз ткани. В крови могут находиться клостридии.

Clostridium novyi

C. novyi обнаружен Нови в 1884 г.

Морфология. C. novyi - крупные, прямые или слегка изогнутые палочки 4-22 × 1,4-1,6 мкм. Часто располагаются цепочками. Подвижны - перитрихи. Во внешней среде образуют овальные споры, располагающиеся субтерминально (ширина спор может быть несколько шире клетки). Капсул не имеют. Грамположительны. Старые культуры могут быть грамотрицательными.

Культивирование. C. novyi - строгие анаэробы. Высокочувствительны к кислороду воздуха. Растут на казеиновых, углеводных и мясопептонных средах при температуре 37-43° С и рН среды 7,4-7,6. На плотных питательных средах через 48 ч вырастают круглые, полупрозрачные колонии с зернистой поверхностью и бахромчатыми краями. В агаровом столбике они образуют хлопьевидные, в виде комка колонии с компактным центром. На жидких питательных средах растут с накоплением газа и выпадением пленок в осадок. На кровяном агаре вокруг колоний наблюдается зона гемолиза.

Ферментативные свойства. C. novyi менее активны, чем C. perfringens. Они сбраживают только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и газа. Протеолитические свойства: молоко медленно свертывают, желатин медленно разжижают. Индол и сероводород не образуют.

Из ферментов патогенности обнаружена фосфолипаза.

Антигенная структура. C. novyi подразделяют на четыре серовара: А, В, С, D, различающихся по антигенным свойствам и синтезируемых ими токсинам.

Токсинообразование. C. novyi синтезируют несколько токсинов, обозначаемых греческими буквами α, β, γ и др.

Экзотоксины обладают некротическим, гемолитическим и летальным действиями. Кроме того, они нарушают проницаемость стенок кровеносных сосудов, что приводит к образованию желеобразного отека.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы C. novyi малоустойчивы. Споры сохраняются во внешней среде в течение многих (25-30) лет. Кипячение убивает их через 40-60 мин, прямые солнечные лучи - через сутки. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их через 15-20 мин.

Восприимчивость животных. К C. novyi чувствительны млекопитающие и птицы (голуби). Из экспериментальных животных: морские свинки, кролики, мыши. При подкожном введении культуры C. novyi у них возникает студенистый желеобразный отек, иногда с газообразованием. Животное погибает через 24 ч.

Clostridium septicum

Clostridium septicum обнаружены Л. Пастером в 1877 г.

Морфология. С. septicum - полиморфная палочка величиной 3-4 × 1,1-1,6 мкм (встречаются нитевидные формы до 50 мкм в длину). Палочки подвижны - перитрихи. Споры располагаются субтерминально, иногда центрально. Капсулу не образуют. Грамположительны. Старые культуры могут окрашиваться грамотрицательно.

Культивирование. C. septicum - строгие анаэробы. Хорошо растут на мясных и казеиновых средах с добавлением 0,5% глюкозы при температуре 37-43° С и рН среды 7,4-7,6. На глюкозокровяном агаре образуют колонии в виде переплетающихся нитей, вокруг которых имеется небольшая зона гемолиза. В глубине столбика сахарного агара - колонии с уплотненным центром и отходящими от краев нитями. В МПБ образуют равномерное помутнение с последующим выпадением рыхлого осадка и газообразования.

Ферментативные свойства. C. septicum обладают сахаролитическими свойствами: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. Не ферментируют маннит и глицерин. Протеолитические свойства: разжижают желатин, молоко свертывают медленно. Переводят нитраты в нитриты, расщепляют белки с выделением сероводорода и аммиака. Не образуют индол (см. табл. 51).

Антигенная структура. C. septicum имеют О- и Н-антигены. По Н-антигенам при помощи реакции агглютинации у них установлено 6 сероваров.

Токсинообразование. Экзотоксин C. septicum состоит из нескольких субстанций: β, θ, γ и др. Основная субстанция - α-токсин обладает летальным, некротическим и гемолитическим свойством. Кроме того, в фильтратах культур C. septicum обнаружен фибринолизин и коллагеназа. Все эти факторы играют большую роль в патогенезе.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы быстро погибают в присутствии кислорода воздуха. Споры менее устойчивы, чем споры других клостридий.

Восприимчивость животных. В естественных условиях болеют домашние животные: крупный и мелкий рогатый скот.

Из экспериментальных животных болеют морские свинки. После внутримышечного введения в лапку культуры C. septicum на месте инъекции развивается интенсивный отек, который распространяется по всей передней стенке живота и животное через 24-48 ч погибает. Из пораженной ткани при надавливании выделяется кровянисто-пенистая жидкость.

Clostridium histolyticum

C. histolyticum выделен Вейнбергом в 1916 г.

Морфология. Небольшие палочки 1,6-3,1 × 0,6-1 мкм. Подвижны - перитрихи. Образуют споры, расположенные субтерминально. Грамположительны.

Культивирование. С. histolyticum - факультативные анаэробы. Растут на мясных и казеиновых средах. На кровяном агаре они образуют небольшие блестящие колонии с ровными краями. Вокруг колоний небольшая зона гемолиза.

Ферментативные свойства. C. histolyticum не обладают сахаролитическими свойствами. Протеолитические свойства выражены: разжижают желатин, лизируют кусочки мяса, помещенные в жидкую питательную среду, при этом образуется сероводород (см. табл. 51).

Токсинообразование. В фильтратах C. histolyticum обнаруживают α-токсин, обладающий летальным и некротическим свойствами. Кроме того, в фильтратах обнаружен β-фактор, разрушающий коллаген (коллагеназа). Этот токсин избирательно действует на клетки поджелудочной железы. Значение C. histolyticum в патологии человека окончательно не выяснено.

Clostridium sordellii

C. sordellii впервые выделены и изучены Сорделли в 1922 г.

Морфология. C. sordellii - палочки 3-4 × 1,1-1,5 мкм. Подвижны - перитрихи. Споры - овальные, располагаются субтерминально или овально. Грамположительны.

Культивирование. C. sordellii - факультативные анаэробы. На поверхности плотных питательных сред образуют серовато-белые, несколько выпуклые колонии. На кровяном агаре дают узкую зону гемолиза. В глубине агара колонии имеют форму чечевиц. В жидких мясных и казеиновых питательных средах быстро растут, образуя слизь.

Ферментативные свойства. C. sordellii обладают сахаролитическими свойствами: расщепляют глюкозу, мальтозу, фруктозу, не расщепляют лактозу и сахарозу. Протеолитические свойства выражаются в медленном разжижении желатина и свернутой сыворотки, они образуют индол, сероводород и уреазу (см. табл. 51).

C. sordellii образуют лецитиназу, гиалуронидазу, гемолизин, фибринолизин.

Токсинообразование. C. sordellii выделяют высокоактивный токсин, обладающий летальными свойствами, похожими по действию на α-токсин C. novyi.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы не обладают устойчивостью. Споры устойчивы и длительно сохраняются в почве.

Восприимчивость животных. У экспериментальных животных C. sordellii вызывает заболевание, похожее на газовую гангрену.

Источники инфекции.^* В окружающую среду клостридии газовой гангрены попадают из кишечника животных, чаще травоядных (при плохих санитарно-гигиенических условиях их можно обнаружить на коже человека).

^* (Нижеизложенный материал относится ко всем рассмотренным представителям рода Clostridium.)

Пути передачи и входные ворота. При повреждении тканей, особенно при обширных рваных ранах, и попадании в рану комков земли, обрывков одежды, осколков снарядов может развиться заболевание. В мирное время газовая гангрена может возникнуть после операции, инъекций лекарств, внебольничных абортов и т. д.

Патогенез. Попавшие в рану споры или вегетативные формы клеток размножаются и выделяют экзотоксин. В процессе размножения клостридии некротизируют здоровую ткань. Особенно интенсивно процесс развивается в мышечной ткани, так как там находится большое количество гликогена, который является хорошей средой для развития анаэробов. Наиболее часто инфекция возникает при глубоких ранах, когда образуются "слепые карманы", которые плохо снабжаются кислородом и создаются благоприятные условия для развития клостридии. Выделяющиеся экзотоксины вызывают явления интоксикации.

Клостридии часто бывают в ассоциации: совместное действие токсинов C. perfringens и C. novyi вызывает более тяжелую реакцию, чем действие раздельных токсинов. В патогенезе анаэробной инфекции большое значение имеет сопутствующая флора (стафилококки, стрептококки и др.), а также реактивность макроорганизма.

Иммунитет. Антитоксический и антибактериальный, однако ведущая роль принадлежит антитоксину. У человека имеется естественный иммунитет, который возникает в результате наличия в кишечнике клостридии. После перенесенного заболевания остается непрочный иммунитет. Более стойкий иммунитет создается при иммунизации анатоксином.

Профилактика осуществляется хирургической обработкой раны (иссечение, разрезы). Для специфической профилактики используют адсорбированный полианатоксин, содержащий анатоксины всех представителей газовой гангрены. Для серопрофилактики при ранениях (чаще в военное время) вводят противогангренозную сыворотку: по 10000 ME C. perfringens, C. novyi, C. septicum, т. е. всего 30000 ME. Используют также смесь анаэробных фагов.

Лечение. Для специфического лечения применяют антитоксическую сыворотку по 50000 ME каждого из клостридии, т. е. всего 150000 ME. Сыворотку вводят внутривенно. Используют также антибиотики: пенициллин и сульфамидные препараты и оксигенотерапию.