Fish – окрашивание хромосом
Революционным достижением цитогенетики был метод FISH - Fluorescence in situ hybridization. При этом радиоактивное мечение ДНК и РНК проб заменили на флюоресцентное. Флюоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.
Для картирования гена нерадиоактивная гибридизация in situ (молекулярная гибридизация на хромосомном препарате) была впервые применена в 1985 году. Метод FISH используют для идентификации точек разрыва, идентификации поврежденных генов, цитогенетического анализа ядра не делящихся клеток.
Флюоресцентная гибридизация in situ: FISH связана с использованием ДНК проб, меченных различными флюорофорами, специфичными для различных хромосом.
FISH сделала доступными для цитогенетического анализа ядра не делящихся клеток. Идентификация хромосом в них осуществляется простым подсчетом сигналов в каждом ядре. Изменение числа сигналов говорит о делеции или амплификации гена.
На современном этапе развития цитогенетики в практику вводятся методы 24-цветной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и метод GTG-дифференциальной окраски хромосом (рис. 2). Данные методы значительно повысили разрешающую способность диагностики хромосомных патологий. Они сделали возможным проведение исследований при полном отсутствии митотических клеток. В целом, методы выявления хромосомных аномалий могут быть разделены на три основные группы: методы общего анализа кариотипа; методы селективного хромосомного анализа и методы общего анализа индивидуальных хромосом.
Метод FISH обеспечил прямую связь между микроскопом и секвенированием. Эта техника позволила увидеть хромосомную локализацию специфических последовательностей ДНК с помощью микроскопа. Прогрессивность методики заключалась в замене радиоактивного мечения ДНК и РНК проб, применяемого с 1969 года, на флюоресцентное. Флюоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго, дают высокое разрешение, и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.
Техника FISH продолжает совершенствоваться, и сегодня локализация сегментов длиною 10 kb считается рутинной, а - 1 kb вполне достижимой. Одним из последних достижений FISH является использование проб, состоящих из пептидов и нуклеиновых кислот, которые позволяют по интенсивности сигнала определять количество комплементарных последовательностей. Хорошей иллюстрацией является изучение динамики теломер в клетках с использованием TTAGGG-специфических проб к концам хромосом. Использование COD-FISH позволяет определять инверсии и сестринские хроматидные обмены.
Появление FISH расширило возможности картирования генома, в частности идентификацию малых хромосомных аномалий. Метод FISH используют для упорядочивания ДНК клонов и идентификации точек разрыва, оценки построенных карт, идентификации поврежденных генов в больших коллекциях картированных сегментов генома человека - космидных, BAC, PAC и YAC. Например, FISH анализ клонов, содержащих перицентрическую инверсию хромосомы 16, обнаруживаемую у пациентов с острой миелогенной лейкемией, привел к идентификации двух генов (MYH11, тяжелой цепи 11 миозина гладких мышц, и CBFB, b-субъединицы ядерно-связывающегося фактора), которые, сливаясь, могут стать причиной лейкемической трансформации. FISH методика легла в основу открытия импринтинга генов региона 15q11-15q13 при синдромах Ангельмана и Прадера-Вилли.
Рисунок 2. FISH-окрашивание метафазных хромосом человека
Широкое изучение генома с применением FISH метода выявило дуплицированные последовательности в удаленных участках генома, представляющие биологический интерес, с точки зрения причины хромосомных перестроек. Что еще более важно, FISH сделала доступными для цитогенетического анализа ядра не делящихся клеток. Идентификация хромосом осуществляется простым подсчетом сигналов в каждом ядре. Изменение числа сигналов свидетельствует о произошедшей делеции или амплификации гена. Так дупликация длиной 1Mb, которая является причиной синдрома Шарко-Мари-Тус, может быть определена интерфазной FISH. Позиционные сдвиги сигналов выявляют структурные перестройки, такие как транслокации и инверсии.
Рисунок 3. Выявление с помощью FISH-окрашивания дупликаций и транслокаций
Интерфазная FISH делает возможным определение относительного количества специфических ДНК последовательностей, которые реплицируются в течение S фазы клеточного цикла. Подобные исследования показали, что большинство материнских и отцовских аллелей локусов реплицируются синхронно, в то время как, для аллелей импринтированных локусов характерна асинхронизация процесса - экспрессирующиеся аллели реплицируются раньше, чем молчащие аллели.
Методом FISH можно различать последовательности ДНК, находящиеся на расстоянии 50-100 kb друг от друга. Последним достижением цитогенетики является использование FISH на нитях ДНК, фиксированных на стекле. При этом маленький сигнал виден в интерфазу в световой микроскоп как флюоресцирующая линия. Эта модификация FISH используется для определения двойственности порядка генов в хромосомном регионе, для анализа организации тандемных дупликаций и определения малых перестроек в хромосомах.
Многоцветное окрашивание хромосом. Последним достижением цитогенетических технологий является анализ многоцветно окрашенных хромосом. Новая методика, получившая название спектрального кариотипирования (SKY) или мультиплексной FISH (M-FISH), появилась в результате трех новшеств. Во-первых, были созданы хромосом-специфические «краски»: коллекции последовательностей, выделенных из каждой хромосомы. Во-вторых, за счет сочетания флюорохромов, для каждой хромосомы получена своя 24-х цветовая комбинация. В-третьих, для многоцветного анализа усовершенствована техника оптической микроскопии, системы фильтрации и отображения, позволяющая автоматически классифицировать каждый хромосомный сегмент. SKY и М-FISH обладают высокой эффективностью выявления транслокаций и других сложных аберраций, например, репликации регионов 11q, 21q и 22q при остром миелоидном лейкозе. Эти методы являются пригодными и для радиационной дозиметрии и для понимания пространственной организации хромосом в ядре. Метод М-FISH позволяет идентифицировать многие ранее не известные перестройки хромосом, особенно их концов.