Окрашивание хромосом
Красители – это сложные органические соединения, имеющие в своем составе хромофорную группу атомов. По происхождению делятся на 3 группы:
животного происхождения – кармин;
растительного – гематоксилин;
минерального – анилиновые красители.
Выделяют 3 основные группы методов окраски.
Простая или рутинная окраска. Уксуснокислый кармин, орсеин, краситель Гимза. Эти красители в стандартных условиях окрашивают хромосомы равномерно по всей длине. Применяется для определения числовых аномалий кариотипа, для выявления структурных хромосомных аберраций.
Дифференциальная окраска хромосом – избирательное окрашивание по длине. В 1968 году Caspersson разработал первый метод дифференциального окрашивания, давший набор из темных и светлых полос по длине каждой хромосомы, что позволило легко идентифицировать хромосомы, выявлять перестройки. Для дифференциальной окраски Касперсон использовал флуоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт (Q-окрашивание). Данное вещество интеркалирует в двойную спираль ДНК и специфически связывается с атомом азота в положении 7 гуанина. Интеркалирование в спираль ДНК приводит к флуоресценции в видимой области спектра – в хромосомах появляются ярко флуоресцирующие участки - полосы или band.
Полосы, окрашивающиеся темным цветом при использовании одного метода, могут оставаться светлыми при использовании других методик. Способы получения полос делятся на две группы: (1)дающие полосы по длине целой хромосомы (G-, Q-, R-полосы); (2) окрашивающие специфические хромосомные структуры. Последним способом окрашивают конституциональный гетерохроматин (С-полосы), теломерные Т-полосы и районы ядрышкового организатора. «Полосатость» хромосом коррелирует с насыщенностью различными основаниями, плотностью упаковки хроматина.
Рисунок 1. Дифференциальное окрашивание хромсоом
В настоящее время основными методами дифференциальной окраски является G-, R-, C-методы. С-окрашивание – метод выявления прицентромерного гетерохроматина. Перед окрашиванием зафиксированных хромосом красителем Гимза их обрабатывают Ba(OH)2 или NaOH. При воздействии щелочи происходит денатурация ДНК. Из-за более плотной упаковки прицентромерный гетерохроматин менее подвержен действию щелочного раствора и способен к ренатурации. При окрашивании красителем Гимза окрашиваются только эти ренатурированные участки хромосомы.
G-окрашивание хромосом. В качестве предварительной обработки хромосом чаще всего используют инкубацию в солевом растворе или инкубацию с трипсином (или другой протеазой). Происходит денатурация и последующая ренатурация. Окрашивание G-сегментов. Предполагают, что данные сегменты богаты А-Т-парами, содержат мало генов (в основном гены тканевой дифференцировки клеток). Q и G-сегменты идентичны. Для материала G-сегментов характерна средняя или поздняя репликация, ранняя конденсация, обогащенность АТ-основаниями и LINE-повторами.
R-окрашивание хромосом. При этом окрашивании хромосомные препараты инкубируют при температуре +60°С в течение 3-5 минут в насыщенном растворе Ва(ОН)2. Затем их окрашивают раствором красителя Гимза. Рисунок хромосом при R-окрашивании противоположен G-исчерченности: R-положительные сегменты содержат большое количество пар G-C; содержат основное число генов, в том числе и гены домашнего хозяйства. Репликация ранняя, конденсация поздняя, обогащенность SINE-повторами.
Окрашивание Ag – специфическое выявление районов ядрышкового организатора, которые были активны в предыдущем клеточном цикле.