3.Технологія виготовлення препаратів.
Вимоги до виробничих штамів.
При виготовленні вакцин черевного тифу і паратифів застосовують вакцинні штами відповідних збудників.
Штами збудників черевного тифу і паратифів А і В повинні знаходитись в S-формі, мати типові морфологічні, серологічні і ферментативні властивості. До складу вакцин необхідно вводити штами, що володіють всіма антигенами, в тому числі і джгутиковим.
Вакцинні штами, що використовуються для виготовлення вакцин проти черевного тифу і паратифів, повинні бути вірулентними для білих мишей. Величина LD50 не повинна перевищувати 50 млн для черевнотифозних і В-паратифозних і 250 млн для А-паратифозних бактерій в ізотонічному розчині хлориду натрію.
Вакцинні штами повинні бути достатньо імуногенні. Доза вакцини, яка захищає 50% імунізованих тварин (ЕD50) при зараженні не менше 3 LD50 тест-культури, повинна становити не більше 30млн при В-паратифозних і 125 млн А-паратифозних (двократна імунізація) штамів
Всі нові штами, які не повинні бути висореактогенними. Випробування реактогенності здійснюють виробничі інститути на обмежених групах людей (не менше 25 чоловік на кожну вакцину, приготовлену з нового штаму).
Вакцинні штами потрібно зберігати паралельно у виробничій лабораторії і музеї культур виробничого інституту у висушеному стані при температурі 4-8°С. Однорідність культур популяції встановлюють шляхом випробувань не менше 10 субкультур однієї і тієї ж генерації, отриманої з окремих колоній за:
Морфологічними властивостями.
Ферментативними властивостями.
Антигенною структурою.
Серологічними властивостями.
Вірулентністю.
Імуногенностю.
Середовища, реактиви.
Черевнотифозні бактерії вирощуються в умовах аерації на білково-гідролізатних середовищах, що дозволяють отримати достатньо високий вихід мікробної маси. Використовуються також штучні і напівштучні поживні середовища.
Регламентовано використання для поживного середовища бульйону з казеїнового гідролізату з різними добавками або бульйону Хоттінгера з гороховим автолізатом. До поживних середовищ висувають такі вимоги:
Бульйон з казеїнового гідролізату повинен бути прозорим, солом’яного кольору, мати рН 7,2 - 7,6 і містити 300-400мг % загального азоту, 200-250мг % амінного азоту і 0.1-0,6% пептону;
Бульйон Хоттінгера з гороховим аналізатором повинен бути прозорим, солом’яно-жовтого кольору, мати рН 7.6 і містити 180-220мг % амінного азоту.
А) Отримання корпускулярних вакцин.
Отримання сухих корпускулярних кишкових вакцин включає декілька стадій: одержання маточної культури, вирощування нативної мікробної маси, інактивація мікроорганізмів, приготування вакцини, розливу в ампули, ліофільного висушування і запайки ампул.
Отримання маточної культури.
Посівним матеріалом є агарова культура в ізотонічному розчині хлориду натрію з густиною 500 млн. мікробних клітин в 1 мл, що вводиться в кількості 5-10% до об’єму середовища.
Вирощування нативної мікробної суспензії.
Для глибинного культивування використовуються реактори з нержавіючої сталі різноманітної ємності, що мають кожух, в який подається пар чи вода. Реактори оснащені системою сифонів для подачі середовища, проведення зливу культур або ферментата після завершення процесів культивування чи ферментації. Повітря подається в реактор через систему вугільно-ватного фільтру. При вирощуванні культури рекомендується вводити повітря в реактор з розрахунку 1л на 1л середовища за хвилину. Додаткове перемішування керованого середовища забезпечується турбінною або роторною мішалкою, швидкість обертання якої 180-300 об/хв. Вирощування в реакторах проводять протягом 6 – 12 год.
З метою інтенсифікації розмноження мікробів і підтримання рН середовища на рівні 7,0 – 7,4 до культур періодично додають 40 % стерильний розчин глюкози з розрахунку її концентрації в середовищі 0,1 –0,2 %. Через кожну годину відбирають проби для дослідження. Задані параметри автоматично реєструються і підтримуються з допомогою контрольно-вимірювальних приладів.
Інактивація мікробної суспензії.
Отриману в глибинних умовах мікробну суспензію для отримання грітої вакцини інактивують нагріванням при 56-58°С протягом 1 год у реакторах з терморегулятором і мішалкою.
При приготуванні спиртової вакцини мікробну суспензію обробляють при ретельному перемішуванні в спеціальних мірниках стерильним 96% етиловим спиртом у співвідношенні 1:4, другий раз 1:10.
Після контролю інактивовану мікробну суспензію розводять ізотонічним розчином NaCl з 0,25% фенолу як консерванта. Розлиту в ампули вакцину заморожують при t від –40 до –500С і висушують у сублімаційних установках. Після ліофілізації ампули запаюють під вакуумом, упаковують.
Спиртова суха черевнотифозна вакцина може бути використана як самостійно, так і при збагаченні її Vi-антигеном.
Б)Виробництво очищеного препарату Vi-антигену.
Принцип методу тому, що Vi- антиген ізолюють з водного екстракту сухої маси черевнотифозних мікробів шляхом трьохкратного переосадження етиловим спиртом в різноманітних умовах.
Спочатку активну фракцію, що містить в собі Vi- антиген, осаджують в інтервалі концентрацій спирту 27-71% після насичення екстракту хлоридом натрію. Отриманий осад після діалізу підкислюють до рН 3,5-3,8 переосаджують при тих же концентраціях спирту . Втретє осадження відбувається в більш вузькому інтервалі концентрацій спирту (27-46-52%) після кислотного гідролізу, який руйнує залишки О-антигену. Отриманий сухий Vi- антиген розчиняють ізотонічним розчином хлориду натрію до концентрації 400 мкг в 1мл і розливають в ампули по 5 мл. Він використовується як розчинник сухої спиртової вакцини.