6.2.2.2. Механизмы транспорта через мембрану

Поверхностная клеточная мембрана (плазмалемма) — основной барьер для транспорта молекул в клетку и из клетки. Строение и состав мембраны обуслов­ливают ее универсальные свойства: полупроницаемость и асимметричность. Транс­порт растворенных веществ через мембрану практически полностью происходит с участием интегральных белков. Кроме того, свойства мембраны обеспечивают возникновение и поддержание электрического мембранного потенциала. Изуче­ние процесса поглощения ионов и понимание того, как вещества переносятся через мембрану, включает две основные проблемы: первая — каковы движущие силы, источники энергии для транспорта; вторая — что из себя представляют сами системы переноса через мембраны, как они действуют и регулируются.

Движущие силы транспорта. Движущая сила переноса ионов на расстояние х — градиент электрохимического потенциала Δ (или Δ /dx) (см. гл. 2).

Существует два основных типа транспорта через мембрану: пассивный, при котором растворенное вещество движется по градиенту электрохимического потенциала без использования дополнительной энергии; и активный, сопря­женный с тратой энергии (например, АТФ или пирофосфата), которая ис­пользуется для перемещения ионов против градиента электрохимического по­тенциала.

Ион пассивно входит в клетку, если _out > _in , где индексы out и in указывают на внешнюю и внутреннюю стороны мембраны соответственно. Когда _in > _out , то ион движется пассивно из клетки. Движение продолжается до установления равновесия, когда _in = _out.

Если в равенство _in = _out поставить уравнение электрохимического потен­циала

(RTlnC_out + zFψ_out = RTlnC_in + zFψ_in) и преобразовать его, то получим уравнение Нернста:

(ψ_out – ψ_in)= E_N = , (6.1)

где разность потенциалов наружной и внутренней стороны мембраны ( ψ_out - ψ_in) представляет потенциал Нернста (E_N). При выражении символами урав­нение Нернста аналогично уравнению Доннана (рис. 6.11). В уравнении Нер­нста E_N предсказывает величину электрического потенциала (мВ), когда его градиент уравновешивает различия в химическом потенциале по обе стороны мембраны. Ионы могут двигаться пассивно в результате действия движущих сил, возникающих из разниц химического потенциала ( ), обусловленного концентрационной асимметрией, и/или разниц электрического потенциала (-∆Е). В соответствии с принципами термодинамики градиент электрическо­го потенциала энергетически может перекрывать градиент химического и тог­да поступление иона внутрь будет идти пассивно, даже если C_in > C_out.

Уравнение Нернста можно использовать как критерий оценки характера транспорта некоторых катионов и анионов. У корней гороха (Pisum sativum), которые поглощали ионы из питательного раствора с известной концентраци­ей, были измерены мембранный потенциал и концентрация ионов в тканях (табл. 6.1).

Таблица 6.1. Измеренные и предсказанные как равновесные концентрации

Ионов (мM • л-1) в тканях корней гороха (p. Sativum), имеющих мембранный

потенциал -110 мВ (по Higinbotham et al., 1967)

Подставив значения измеренного ∆Е и концентрации ионов в среде в уравнение Нернста, можно найти «равновесную» концентрацию ионов в тканях.

Из сравнения рассчитанных (равновесных) и действительных (измеренных) концентраций ионов в тканях были сделаны следующие выводы: 1) распределе­ние К между раствором и корнями гороха практически равновесное; 2) Са , Mg , Na транспортируются пассивно, но их концентрация в тканях значитель­но ниже (особенно, для Са ), чем равновесная, рассчитанная по уравнению Нернста; это предполагает либо исключительно низкую проницаемость мембра­ны для этих ионов, что маловероятно, либо активный механизм их выкачива­ния из клетки; 3) анионы транспортируются активно, а поскольку различия мембранного потенциала отрицательны относительно внутреннего компартмента и концентрация анионов в корне выше, чем снаружи, их поглощение идет активно, против градиентов и электрического, и химического потенциалов.

Основной вклад в создание электрического потенциала на клеточных мем­бранах (плазмалемме, тонопласте, мембране ЭР) вносят диффузионный по­тенциал (E_d), который является результатом пассивного транспорта ионов, и электрогенный потенциал (Еp), возникающий вследствие активного (с ис­пользованием энергии) выкачивания протона.

Диффузионный потенциал обусловлен разницей в проницаемости мембра­ны (Р) для катионов и анионов, что приводит к различиям в величине пото­ков ионов через мембраны. Если по обе стороны мембраны (в отсеках «А» и «Б») находится раствор с разной концентрацией КО (рис. 6.12) и мембрана более проницаема для К⁺, чем для Сl (Р > P ), то диффузия К⁺ из отсека «А» (концентрация КС1 100 мМ) в отсек «Б» (концентрация 1 мМ) будет происходить быстрее, чем СГ. В течение короткого времени быстрое переме­щение К⁺ и относительно медленное СГ приведет к небольшому разделению зарядов и накоплению на поверхности мембраны в отсеке «А» слабо диффун­дирующего аниона, а на поверхности в отсеке «Б» — катиона. Вследствие этого на мембране возникает отрицательный электрический потенциал (-∆Е). В жи­вой клетке количество заряда, которое должно разделиться для возникнове­ния ∆Е -100 мВ (типичная величина для плазмалеммы), ничтожно мало по сравнению с суммой положительных и отрицательных зарядов в цитоплазме: по расчетам достаточно присутствия одного лишнего аниона снаружи на каж­дые 100 000 в клетке. Образование ∆Е замедляет перемещение К⁺ и даже приво­дит к некоторому обратному выходу К⁺ в отсек «А».

Рис. 6.12. Возникновение диффузионного потенциала (E_d) при разной проницаемости

(Р) мембраны для катиона и аниона (Р > P ):

а — исходная система электронейтральна; б — возникает -∆Е; при равновесии потоков через

мембрану между ее наружной (А) и внутренней (Б) поверхностью электрический потенциал

мембраны соответствует диффузионному потенциалу E_d; стрелки — градиенты химических и

электрического потенциалов и их направления

Когда градиент электри­ческого потенциала достигает некоего постоянного уровня, нетто-перемещение К из «А» в «Б» прекратится. Разность концентраций, которая может со-

храниться ([Кд] > [Kg]), уравновесится градиентом электрического потенциа­ла, названного диффузионным — E_d. Поскольку СГ также перемещается через мембрану, то стационарный градиент концентрации К⁺ (А[К⁺]) и E_d будут ниже, чем в случае, когда диффузии аниона не происходит. Величина E_d может быть рассчитана из уравнения Гольдмана, где Р — коэффициент проницаемости:

. (6.2)

Итак, величина E_d является функцией концентрации ионов в растворе и проницаемости мембраны, и уравнение Гольдмана позволяет описать вклад пассивных ионных потоков и E_d в общий мембранный потенциал.

Поддержание трансмембранного электрического потенциала обеспечивает­ся также процессом активного переноса через мембрану протона (Н⁺). Выкачи­вание Н⁺ осуществляют протонные помпы — интегральные белки мембран, проявляющие гидролитическую активность. Работа

Н⁺-помпы сопряжена с ис­пользованием энергии, которая поставляется главным образом за счет гидроли­за АТФ. В этом случае выкачивание Н⁺ и создание электрогенного потенциала Е_р связаны с функционированием Н⁺-АТФаз (рис. 6.13).

Рис. 6.13. Образование электрогенного потен­циала (Е_р) на плазмалемме (ПМ) и тонопласте (ТП) с участием Н⁺-АТФазы

Обычно у растений на плазмалемме поддерживается градиент (цитозоль → апопласт) отрицательного элек­трического потенциала в пределах от -120 до -160 мВ (возможны вариации от -100 до -300 мВ), и на внутренней (цитозольной) стороне мембраны потенци­ал более отрицательный, чем на внешней. На тонопласте ∆Е (вакуоль → цито­золь) в среднем составляет +30 мВ (меняется от 10 до 70 мВ), и внешняя сторона тонопласта, так же как у плазмалеммы, имеет более отрицательный заряд.

Электрогенный потенциал (Е_р) вместе с диффузным (E_d) обеспечивают со­здание на плазмалемме суммарного градиента электрического потенциала (∆Е). При этом вклад Е_р в суммарную величину мембранного потенциала у растений составляет более половины, что гораздо больше, чем у животных, у которых основной вклад в ∆Е плазмалеммы вносит диффузионный потенциал (90 — 95 %).

У всех биологических мембран потенциал регулируется внутри ограничен­ных пределов, что важно по ряду причин. Обычный цитозоль-отрицательный потенциал плазмалеммы обеспечивает движущую силу для пассивного (электрофоретического) транспорта ионов против их химического потенциала. Мем­бранный потенциал играет ключевую роль в некоторых системах клеточной сигнализации. Деполяризация мембраны (сдвиг -∆Е в сторону более положи­тельных значений), вызванная некоторыми воздействиями, приводит, напри­мер, к активации Са -каналов, являющихся компонентами путей передачи информации (см. подразд. 3.4.3). Кроме того, уровень потенциала на мембра­не должен поддерживаться в пределах, активирующих электрогенную помпу (Н⁺-АТФазу), которая удаляя из цитозоля метаболически продуцируемый Н⁺, стабилизирует рН цитозоля и обеспечивает движущую силу для активного по­ступления ионов. При активации Н⁺-АТФазы мембрана может гиперполяризоватъся, т.е. ее потенциал станет еще более отрицательным. Некоторые ионные каналы активируются в этих условиях, выполняя определенные функции в тех или иных физиологических процессах (см. подразд. 3.5.3).

Н⁺-помпы мембран растительной клетки. У растений наиболее весомый вклад в энергизацию мембран вносят три типа помп: Н⁺-АТФаза плазмалеммы (ПМН⁺-АТФаза), выкачивающая Н⁺ из клетки, и Н⁺-АТФаза (VН⁺-АТФаза) и пирофосфатаза (Н⁺-ПФаза) на тонопласте, которые вытесняют Н⁺ из цитозоля в вакуоль (рис. 6.14).

Н⁺-помпы могут быть идентифицированы по их гидролитической активно­сти, связанной с использованием АТФ или пирофосфата (ФФ_Н). Белок Н⁺-помп составляет 1 — 5 % от очищенного белка мембран, что выше, чем для каких-либо других транспортных белков. Возможно, их обилие в мембранах компен­сирует низкую скорость транспорта протонов, которая составляет около 100 ионов в секунду или менее (котранспортеры переносят 300 —1000 ионов/с, а через каналы могут переносится 10⁶—10⁸ ионов/с).

Н⁺-АТФаза плазмалеммы. Этот комплекс представлен единственным поли­пептидом с молекулярной массой 100 кД и относится к Р-типу АТФаз, обра­зующих в ходе реакции промежуточный фосфорилированный продукт (аспартил фосфат). Субстратом для

ПМН⁺-АТФазы служит МgАТФ и константа Михаэлиса К_т варьирует у растений от 0,3 до 14 мМ; оптимум рН около 6,6. Моно­мер образует 10 интегрированных в мембране доменов, а с цитозольной сто­роны между 4-м и 5-м доменами — гидролитическую петлю, на которой нахо­дится АТФ-связывающий участок (рис. 6.14). Стехиометрия удаления Н⁺ и гид­ролиза АТФ (Н⁺/АТФ) равна единице.

Механизм протонного транспорта с участием этой помпы еще окончатель­но не выяснен. Каталитический цикл, обеспечивающий выкачивание Н⁺, предполагает следующую ступенчатую последовательность: связывание Н⁺ и на участке D — Mg-АТФ, затем образование высокоэнергетического продукта (аспартил фосфата) и высвобождение АДФ; как следствие этих реакций про­исходят конформационные изменения фермента, которые приводят к высво­бождению Н⁺ с наружной стороны плазмалеммы; возвращение фермента после высвобождения Ф_н в исходное состояние. Работу этой помпы ингибирует ванадат. Предполагают, что он имитирует Ф_н, и связывание ванадата в актив­ном центре блокирует переход фермента в исходное активное состояние.

Рис. 6.14. Предполагаемые структурные модели Н⁺-помп растительной клетки (моди­фикация по: Sze et al., 1999; Morsomme, Boutry, 2000; Rutajczak, 2000; Maeshima, 2001):

/ — Н⁺-АТФаза плазмалеммы (ПМН⁺-АТФаза): 1 —10 — участки полипептидной цепи, пересе­кающие ПМ; D — каталитический участок, содержащий аспартатный остаток, связывающий Mg-АТФ; AID — автоингибиторный домен

С-конца, который вследствие фосфорилирования

протеинкиназой и присоединения 14-3-3-белка переводит ПМН⁺-АТФазу из неактивной (НАк) в активную (Ак) форму; // — вакуолярная Н⁺-АТФаза (VН⁺-АТФаза): V₁ — цитозольная, V_o — мембранная части комплекса; A—G — субъединицы V₁; a—d — субъединицы V_o. Детали пространственного расположения субъединиц С, Е, F, G, Н и d у

VН⁺-АТФазы не выяснены (по Maeshima, 2001); ///— вакуолярная пирофосфатаза (Н⁺-ПФаза): 1 —14 — участки полипеп­тидной цепи Н⁺-ПФазы, пересекающие мембрану (домены 3, 4 и 8— 13 не представлены); ГП — гидрофильная цитозольная петля между 5-м и 6-м трансмембранными доменами с консерватив­ным сегментом (CS1) и местами связывания субстрата (Mg-ФФ_н), К⁺ и Mg

На посттрансляционном уровне ПМН⁺-АТФаза регулируется с участием протеинкиназы/протеинфосфатазы и 14-3-3-белка (рис. 6.14, /). В состоянии низ­кой активности реакционный центр фермента блокирован автоингибиторным доменом, расположенным на С-конце полипептида. Активация Н⁺-АТФазы осуществляется при последовательных реакциях фосфорилирования и присо­единения 14-3-3-белка на автоингибиторном участке. В результате происходят конформационные перестройки, вызывающие перемещение С-конца, и реак­ционный центр становится доступным для присоединения Mg-АТФ и протона. Давно известен эффект активации ПМН⁺-АТФазы фузикокцином (токсиче­ское соединение, продуцируемое грибом Fusicoccwn amigdali). Оказалось, что и в этом случае полная активация Н⁺-АТФазы достигается, если к С-автоингибиторному домену присоединяются не только фузикокцин, но и 14-3-3-белок.

Н -АТФазы плазмалеммы растительных клеток кодируются мультигенным семейством: идентифицировано 10 генов у арабидопсиса (Arabidopsis), 9 у та­бака (Nicotiana), 7 генов у томата (Lycopersicon) и 5 у бобов (Viciafaba). В ряде случаев разные гены кодируют отдельные изоформы, и высокий уровень их экспрессии коррелирует с накоплением Н⁺-АТФаз в специфических типах клеток, например клеток корневого волоска (aha2), или флоэмы (aha3), где Н-помпы участвуют в выполнении специфических физиологических функций (поглощение ионов, транспорт Сахаров). Другие Н⁺-АТФазные гены экспрессируются в клетках многих тканей. Например, ген рта4 табака экспрессируется в клетках эпидермиса корня, в сопровождающих клетках флоэмы и замыка­ющих клетках устьиц. При действии факторов среды (солевой стресс, низкий ψ , темнота) уровень экспрессии генов ПМН⁺-АТФаз также может меняться.

Вакуолярная Н⁺-АТФаза (VН⁺-АТФаза) присутствует не только в тонопласте, но и в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР), аппарата Гольджи, везикулах. VН⁺-АТФаза отличается от Н⁺-помпы плазмалеммы по всем основным параметрам, характеризующим свойства и структуру. Прежде всего, это не мономерная полипептидная цепь, а самый большой многосубъединичный белковый комплекс тонопласта с молекулярной массой, по разным ис­точникам, от 650 до 750 кДа. Величина К_т для Mg-АТФ у VН⁺-АТФазы со­ставляет от 0,1 до 0,2 мМ, т.е. ниже, чем у

ПМН⁺-АТФазы, а соотношение Н /АТФ, наоборот, выше (от 2 до 3), что свидетельствует о различии их кине­тических параметров. Специфические ингибиторы VН⁺-АТФазы — бафиломи-цин А, конканамицин С и нитрат. При связывании АТФ и выкачивании прото­на в вакуоль не образуется промежуточного фосфорилированного интермедиата и, таким образом, VН⁺-АТФаза не относится к АТФазам Р-типа. По своей четвертичной структуре VН⁺-АТФаза сходна с

АТФ-синтазой F-типа мито­хондрий и хлоропластов (см. гл. 2) и представлена двумя функциональными частями: цитозольной (V₁) и мембранной (V_o) (рис. 6.15, //). Ансамбль V₁ где происходит гидролиз АТФ, состоит из 5 —8 типов субъединиц, а инте­гральная часть (V_o) представлена 3 — 5 типами субъединиц и функционирует, как Н -канал. У разных видов растений выявлено разное количество типов субъединиц и некоторые субъединицы V₁ и У₀-частей присутствуют в несколь­ких копиях.

V₁-комплекс включает по три повторности субъединиц А и В, которые соот­ветствуют α- и β-субъединицам F-АТФаз и осуществляют каталитическое (А) и некаталитическое (В) связывание АТФ (рис. 6.14, //). Субъединица D, соот­ветствующая γ-субъединице F-АТФазы, выполняет роль связующего стержня между периферийной (V₁) и мембранной (V_o) частями. Остальные субъединицы V₁-комплекса (от С до Н) выполняют функции стабилизации, поддержа­ния активности, обеспечения контакта и сопряжения работы V₁ и У₀-частей. Точное пространственное расположение субъединиц С —Н в общем мультигетерогенном ансамбле VН⁺-АТФазы пока не установлено.

Интегральный V₀-комплекс содержит большую (100 кД) субъединицу а, шесть или более субъединиц с (их молекулярная масса равна 16 кД, т. е. вдвое выше, чем у с-субъединиц

F-АТФазы) и субъединицу d (32 — 36 кД) (рис. 6.14, II). Как установлено на дрожжах, взаимодействие между а- и с-субъединицами обеспечивает путь для транспорта протона через мембрану. Данные о связи субъединицы а с комплексом V₁—V_o и ее функциях противоречивы. Возмож­но, она имеет отношение к агрегации комплекса, а не к транслокации Н⁺, или

a-субъединица функционирует как статор в относительно слабой ассоциа­ции с гексамером из с-субъединиц.

Хотя VН⁺-АТФаза растений, как и других организмов, ингибируется специ­фическим токсином бафиломицином А₁ субъединица, которая его связывает, не выявлена (у бычьего фермента это субъединица а). Так что, модели структуры растительной VН⁺-АТФазы, которые имеются в настоящее время, в значитель­ной мере гипотетичны (рис. 6.14, II), а функции отдельных субъединиц часто предположительные. К настоящему времени большинство субъединиц

VH⁺-АТФазы Arabidopsis (кроме F-13 кД, Н-51 кД, а-100 кД и d~45 кД) клонированы.

Предполагают, что механизм превращения одной формы энергии в другую (АТФ ↔ Δ ) у

VН⁺-АТФазы и F-АТФ-синтазы сходен, но реакции, связан­ные с АТФ, идут в противоположных направлениях. Ротационный механизм катализа сопрягает проводимость протона через V_o (или F_o) с гидролизом АТФ в V₁ -комплексе и с синтезом в F₁.

Пирофосфатаза (Н⁺-ПФаза) — помпа, альтернативная VН⁺-АТФазе, пере­качивающая протон из цитозоля в вакуоль (рис. 6.14, ///). Источником энергии для Н⁺-ПФазы служит пирофосфат (ФФ_Н) — простейшее высокоэнергетиче­ское соединение, и стехиометрия реакции НУФФ_Н равна 1, а скорость транс­порта протона ниже, чем у двух других Н⁺-помп. Н⁺-ПФаза имеет молекуляр­ную массу 80 — 81 кДа и представлена единственной полипептидной цепью из 14 мембранных доменов и нескольких гидрофильных петель (на рис. 6.14, /// представлены не все домены и только одна петля). N- и С-концы находятся на вакуолярной стороне тонопласта. Функциональный участок находится на цитозольной петле между 5-м и 6-м доменами и включает один из консерватив­ных мотивов (указан как консервативный сегмент CS1), где происходит свя­зывание и гидролиз Mg-ФФ_H, а также транспорт Н⁺. Механизм сопряжения этих реакций неясен, но установлено, что важную роль в связывании и гид­ролизе играют кислые остатки аминокислотной последовательности участка CS1. Активность фермента ингибируется Са и стимулируется К⁺ и Mg , для которых имеются сайты связывания. Предполагается, что Са блокирует реак­цию гидролиза пирофосфата магния (Mg-ФФн), заменяя его на пирофосфат кальция (Са-ФФ_н).

Н⁺-ПФазы клонированы из многих организмов (высших наземных растений, водорослей, фотосинтезирующих бактерий и простейших), но в клетках млекопитающих и дрожжей они отсутствуют.

Функции Н -помп в растительной клетке. Электрогенные помпы благодаря поддержанию и регуляции электрохимического протонного градиента обеспе­чивают движущую силу для перемещения веществ через мембрану. Выкачива­ние Н⁺ (иначе, первичный транспорт) и генерация Δ ведет к образованию альтернативной к АТФ форме энергии (см. гл. 2), которая может быть исполь­зована для активного вторичного транспорта других ионов. Возвращение Н⁺ через мембрану по градиенту Δ , сопряженное с перемещением через мемб­рану других веществ (минеральных, органических ионов и нейтральных моле­кул), обеспечивает их активный транспорт против градиента электрохимиче­ского потенциала (рис. 6.15).

Рис. 6.15. Схема основных систем транспорта ионов через плазмалемму (ПМ), мембра­ны вакуоли (В) и эндоплазматического ретикулума (ЭР) в растительной клетке.

Справа представлены помпы и транспортеры (¹А — анионы; ²С — катионы; S — органические вещества: сахара, аминокислоты, органические кислоты); слева — каналы (⁴РУ — рецептор-управляемые каналы; ⁵БВ и MB — быстрые и медленные вакуолярные каналы; ⁷VD — потенциалзависимый канал; in и out — входной и выходной каналы; макси «кат» — неспецифический Са , К⁺ входной канал). Пунктиром показана связь транспорта иона с транспортом Н⁺ и рабо­той Н⁺-АТФазы

С участием Н⁺ -помп поддерживается гомеостаз рН в цитозоле, подкисляют­ся вакуолярный сок и среда в клеточной стенке (рис. 6.13 и 6.15), что необхо­димо для протекания целого ряда процессов, активности ферментов и функ­ционирования транспортных систем. Реализуя свои функции, Н⁺-АТФазы уча­ствуют в таких физиологических процессах, как устьичные движения, осморегуляция, устойчивость к солевому стрессу и низким значениям рН среды, поступление Сахаров и аминокислот из апопласта в клетки, загрузка флоэмы, клеточный рост и др.

Общая характеристика белков, транспортирующих минеральные вещества. Своеобразный по количеству и качеству состав минеральных элементов в рас­тительных клетках — результат активности специфических интегральных бел­ков мембран, транспортирующих ионы, исходным источником которых явля­ется окружающая среда. По своим биохимическим, термодинамическим и мо­лекулярным характеристикам, а также механизмам регуляции системы транс­порта ионов могут быть разделены на несколько основных групп: АТФазы, переносчики, или котранспортеры, и каналы (рис. 6.15).

Особая группа АТФаз Р-типа — Са v-АТФазы. Они присутствуют в плазма-лемме, тонопласте и других мембранах растительной клетки (рис. 6.15). Основ­ная функция Са -АТФаз — поддержание низкой концентрации Са в цитозо­ле, что необходимо для реализации его роли вторичного мессенджера (см. подразд. 3.4.2). Кальциевые помпы плазмалеммы включены в радиальный транс­порт Са в корнях (см. подразд. 2.3.1).

У животных в создании и регуляции электропотенциала на клеточной мемб­ране большая роль принадлежит Nа⁺/К⁺-АТФазе. У фотосинтезирующих одно­клеточных водорослей (но не у высших растений) обнаружена Nа⁺-АТФаза, которая удаляет Na⁺ из клетки (см. гл. 8) и так же, как

Са²⁺-АТФаза, не вносит существенного вклада в поддержание ∆Е на плазмалемме.

Таким образом, для активного перемещения Са²⁺ и Na⁺ из цитозоля против их градиентов электрохимического потенциала энергия АТФ используется не­посредственно при работе Са²⁺- и Nа⁺-АТФаз.

Переносчики, или транспортеры. Концепция переносчиков (carrier) была разработана в 1960-е гг. на основании ставших классическими исследований Э. Эпштейна с соавт. и других научных групп кинетики поглощения ионов клет­ками водорослей и отсеченными, так называемыми «обессоленными», корня­ми растений, выращенных на воде или временно перенесенных на воду. По­глощение «обессоленными» корнями рассматривается как поглощение клеткой, при этом проводится аналогия между механизмами поддержания ионно­го баланса клеткой и целым корнем, в котором апопласт уподобляется стенке клетки, симпласт — цитозолю, а вакуом корня — вакуоли одиночной клетки. Результаты таких исследований были использованы для разработки клеточной модели корня (см. подразд. 6.2.4.2; рис. 6.32). Позднее исследование кинетики поглощения проводили также на выделенных протопластах и сконструирован­ных мембранных везикулах.

Скорость поглощения К⁺ отсеченными корнями ячменя меняется при из­менении концентрации КС1 в растворе, и изотерма поглощения имеет вид гиперболической кривой подобной кривой кинетики насыщения для реак­ции, катализируемой ферментом (рис. 6.16, А). Поэтому, как и кинетика фер­ментативной реакции, зависимость скорости поглощения от концентрации иона соответствует уравнению Михаэлиса—Ментен:

, (6.3)

где V — наблюдаемая скорость поглощения при концентрации иона [C]_out в растворе; V_max — скорость, достигаемая при выходе на плато, когда увеличение [C]_out не приводит к увеличению скорости поглощения (вследствие насыще­ния связующих мест переносчика); К_т,каж — кажущаяся константа Михаэлиса—Ментен, соответствующая [C]_out при достижении V_max.

По аналогии с ферментной реакцией К_т,каж характеризует сродство транс­портера к иону: чем ниже К_т,каж, тем эффективнее работает переносчик при низких концентрациях ионов в растворе. V_max отражает (условно) число мест переноса (количество фермента в ферментативной реакции) и определяет воз­можности системы транспортировать ион при его высоких концентрациях.

При исследовании кинетики поступления были получены двухфазные и даже многофазные кривые, на основании которых были постулированы, а за­тем и выявлены системы транспорта, достигающие насыщения в разных диа­пазонах внешних концентраций и с разным сродством к иону (рис. 6.16): меха­низм I – с небольшой V_max и высоким сродством (низкая К_т) к иону (высоко-афинные переносчики) и механизм II — с низким сродством (высокой К_т) и высокой V_mах

(рис. 6.16, А), а в ряде случаев (рис. 6.16, Б) с несколькими точками насыщения.

Рис. 6.16. Скорость поглощения как функция концентрации иона в растворе: А — изменение скорости поглощения К⁺ отрезанными корнями ячменя при низких (7) и высо­ких (2) концентрациях КСl в среде (Epstein, 1966); Б — многофазная (фазы 1 — 4) кинетика скорости поглощения К⁺ по механизму II (пунктирная линия — V_mах поглощения по механизму I) (Epstein, Hains, 1965); В — скорость поглощения нитрата диким типом (1) и che 1 мутантом В1 (2) Arabidopsis в зависимости от концентрации NO в среде (по Daddema, Telkamp, 1979); Г — многофазная кинетика (фазы 1—5) скорости поглощения фосфата из растворов с разной кон­центрацией; фосфатом снабжали только участок корня кукурузы (по Nandi et al., 1987); К_т — константа Михаэлиса

Переносчики перемещают растворенные вещества либо против, либо по градиенту электрохимического потенциала со скоростями 10²— 10⁴ ионов в се­кунду. Однако в зависимости от условий, при которых они исследуются, транс­портеры иногда ведут себя как каналы, или, наоборот, каналы ведут себя подобно транспортерам (особенно это касается К⁺), поэтому различия между ними в настоящее время не совсем ясны. Активное перемещение, или вторич­ный транспорт, ионов и других веществ происходит одновременно (или в котранспорте) с Н⁺ и обеспечивается конформационными изменениями транс­портирующего белкового комплекса. Котранспорт протона и иона может идти в одном (симпорт) или в противоположном (антипорт) направлениях (см. рис. 6.15). В симпорте с протоном через плазмалемму транспортируются анио­ны, К⁺ (при низких концентрациях), а также сахара и аминокислоты. В анти­порте с Н⁺ переносятся Na⁺ через плазмалемму и тонопласт, а Са²⁺ , сахароза и гексоза через тонопласт. Некоторые переносчики функционируют на плазмалемме в системе унипорта.

Исследование кинетики поглощения К⁺ отрезанными корнями ячменя из раствора КСl в широком диапазоне концентраций (E.Epstein et al, 1963) по­казало, что при поступлении К⁺ как в области низких (< 1 мМ), так и высоких концентраций (>1 мМ) изменение скорости следует кинетике Михаэлиса – Ментен (рис. 6.16). При низкой концентрации поглощение происходит актив­но (механизм I) и, видимо, в симпорте с Н⁺ (см. рис. 6.15), а при высокой (механизм II) — пассивно. Первый высокоафинный К⁺-транспортер НКТ1 (highaffinity К⁺ transporters 1) был идентифицирован в корнях пшеницы. Другой транспортер К⁺ из корней AtKUP1 (Arabidopsis taliana K⁺ uptake) функциониру­ет в зависимости от предшествующих условий выращивания растений (голода­ние или обеспечение К⁺) как переносчик с высоким (К_т 44 мкМ) и низким

(К_т 11 мМ) сродством к К⁺ (см. подразд. 6.3.5).

По градиенту электрохимического потенциала в системе унипорта через мембрану переносится цинк (см. рис. 6.15). Его транспортер идентифицирован у Arabidopsis (ZIP 1 — 4). Экспрессия ZIP1 и ZIP3 в корнях растений, голода­ющих по цинку дает основание считать, что эти транспортеры участвуют в поглощении Zn²⁺ из почвы.

Анионы транспортируются против градиента химического потенциала, и концентрация NO и РО в тканях в десятки и даже сотни раз превышает равновесную, предсказанную из уравнения Нернста (см. табл. 6.1). Поглоще­ние анионов имеет ту особенность, что не только низкоафинные, но и высокоафинные переносчики электрогенны, т. е. функционируют в сопряжении с Н⁺-помпой.

Поглощение NO осуществляется транспортерами высокого и низкого срод­ства и в обоих случаях происходит симпорт 2Н⁺/ NO . При низкой концентра­ции скорость поглощения NO соответствует кинетике Михаэлиса—Ментон, достигая насыщения при 0,1 — 0,5 мМ (рис. 6.16, В). При дальнейшем увеличе­нии концентрации скорость опять возрастает. Но у дикого типа Arabidopsis за­висимость скорости V как функции от [NO ] в среде гиперболическая, а у мутанта che1 — линейная, что является ярким примером генетического конт­роля транспортных систем.

Фосфор транспортируется активно в виде иона Н₃РО₄ в симпорте с Н⁺. Концентрация Р в почвенном растворе чрезвычайно низкая (см. рис. 6.2), но может сильно возрастать, например, после внесения удобрений. Растения при­способились использовать фосфор как при низкой, так и при высокой кон­центрации. Функционируют две системы поглощения Н₂РО : система I с вы­соким сродством (К_т 3 – 7 мкМ), которая экспрессируется или деэкспрессируется при голодании по фосфору, и система II, представленная конститутив­ными переносчиками с низким сродством (К_т изменяется от 50 до 350 мкМ), проявляющими многофазность кинетики насыщения в зависимости от кон­центрации (рис. 6.16, Г).

Ионные каналы — большая и разнообразная группа интегральных белковых комплексов, которые присутствуют во всех клеточных мембранах (см. рис. 6.15). Одна из основных функциональных характеристик каналов — их способность распознавать и достаточно селективно, с высокой скоростью (10⁶—10⁸ ион/с) транспортировать ионы. Перемещение ионов по каналу происходит по гради­енту , т. е. пассивно, и основной составляющей движущей силы часто является разность концентраций иона по обе стороны мембраны. Другая особенность каналов — регуляция их пропускной способности в ответ на специфические стимулы. Активность каналов модулируется мембранным потенциалом, рН, концентрацией ионов, внутриклеточными сигнальными молекулами и рядом других эндогенных и экзогенных факторов.

Большой прогресс в исследовании функциональной активности и регуля­ции ионных каналов был достигнут благодаря разработке метода «пэтч-кламп» (patch clamp). Метод основан на локальной фиксации потенциала на мембране и измерении проводимости тока, которая отражает проницаемость иона через одиночные ионные каналы с использованием протопластов клеток, изолиро­ванных вакуолей или везикул выделенных мембран. По признаку ионной спе­цифичности каналы классифицируются по видам переносимых катионов (ка­лиевые, кальциевые) и анионов (хлоридные, малатные) (см. рис. 6.15). При более детальной функциональной систематизации каналов учитываются про­водимость и селективность каналов, направление транспорта иона, принад­лежность к разным мембранам, способы регуляции, электрические и фарма­кологические характеристики. При этом основные характеристики, используе­мые для классификации каналов, транспортирующих тот или иной ион, могут быть разными. Калиевые каналы плазмалеммы подразделяются на входные (inward) и выходные (outward), а калиевые каналы тонопласта — на быстрые (fast) и медленные (slow) в зависимости от скорости их активации (см. рис. 6.15). Кальциевые каналы, участвующие в передаче информации и определяющие специфику кальциевого сигнала (см. подразд. 6.3.4), делятся на потенциал- и рецептор-управляемые и классифицируются по местоположению в мембранах (плазмалемма, тонопласт, эндоплазматический ретикулум) и характеру регу­ляции. Важные характеристики анионных каналов (исследованы, главным об­разом, хлорные каналы) — их селективность, направление движения ионов (in, out) и кинетика (быстрые, медленные), а также локализация в мембранах.

Свойство селективности, как правило, не является абсолютным, а отражает преимущественную проводимость определенного иона (при физиологических концентрациях часто близкую к абсолютной). В настоящее время выявлена це­лая группа неселективных катионных каналов (НСКК — английская аббреви­атура NSCC). Среди них наибольший интерес представляют

К⁺/Са²⁺-«макси»-катионный канал замыкающих клеток устьиц Viciafaba (см. рис. 6.15), потен­циал нечувствительный К⁺/NН -канал корней A. taliana и К⁺/Na⁺-канал кор­ней пшеницы. Вакуолярный анионный входной канал пропускает Cl^- , NO и малат²⁺.

Сложность при классификации каналов связана также с необходимостью совмещать известные электрофизиологические и биохимические характери­стики с результатами их идентификации на молекулярном уровне. Например, К⁺-каналы, согласно их молекулярно-структурным характеристикам (число доменов и гидрофильных петель и др.) (см. рис. 6.18), разделены на четыре типа (семейства). К так называемому «шейкерному» семейству (Shaker family) относят идентифицированные у A. taliana К⁺-каналы с разными функциями: АКТ1 (Arabidopsis thaliana K⁺ transporters) экспрессируется в эпидермисе и коре корня и связан с поступлением К⁺ из среды; КАТ1 (К⁺ Arabidopsis transporters) переносит К⁺ в замыкающие клетки устьица, a SKOR (stellar K⁺ outward rectifier) осуществляет загрузку ксилемы (см. подразд. 2.3.2; 3.5.1).

Ионная специфичность, пропускная способность, характер регуляции и другие свойства канала определяются его структурой. По модели, разработан­ной главным образом на базе исследования Na⁺/K⁺- и К⁺-каналов животных, ионы перемещаются по специальной структуре — поре, которая имеет по­лость, заполненную водой, и множество мест связывания (рис. 6.17).

Рис. 6.17. Структурно-функциональные элементы условной модели потенциалзависимого ионного канала.

Изменение положения «воротных» доменов α-субъединиц указано стрелками; (-) и (+) — заряды на участках селективного фильтра и сенсора

Пора фор­мируется отдельными участками полипептидных цепей гомологичных α-субъединиц. Часть поры канала, находящаяся на внешней стороне плазмалеммы, достаточно широкая (не менее 1 нм в диаметре), названа «устьем». Централь­ная часть гидрофильной поры имеет меньший диаметр («0,7 нм), величина которого варьирует в разных местах. Зона, где находится, так называемый се­лективный фильтр, — самая узкая часть поры (0,4 — 0,5 нм). Благодаря селек­тивному фильтру пропускная способность калиевого канала для К⁺ в 100 и более раз выше, чем для Na⁺. Механизм, который контролирует активность канала, был объяснен с помощью английского слова «gate», для которого в русском варианте был выбран термин «ворота». Управление активностью осуществляется благодаря переходу канала в состояния «открытый — закрытый» (через открывание/закрывание или отпирание/запирание канала) при помо­щи воротного механизма (рис. 6.17). Регуляция активности потенциалзависимых каналов обеспечивается по крайней мере двумя системами: сенсором по­тенциала, индуцирующего открывание ворот канала, и системой, которая инактивирует воротный механизм, приводя к закрыванию канала. В обоих случаях происходит обратимое изменение конформации субъединиц на участках поры, составляющих структуру ворот и обеспечивающих функционирование ворот­ного механизма.

Исследования К⁺-каналов Shaker-типа, проведенные на дрозофиле (Drosophila) и арабидопсисе, стали базой для моделирования механизма активации канала в зависимости от изменения мембранного потенциала и для выяснения взаи­мосвязи между структурой и функцией. У растений К⁺-канал Shaker-типа (АКТ1, КАТ1, SKOR) представляет собой гомотетрамер (рис. 6.18, Б), у которого полипептидная цепь каждой из четырех α-субъединиц имеет 6 трансмембран­ных участков (segments): S1 —S6 (рис. 6.18, Л).

Рис. 6.18. Структура калиевого канала Shaker-типа: А — трансмембранная топология полипептидной цепи: S1—S6 — трансмембранные сегменты;

S4 — сенсорный участок; Н5(Р) — гидрофильная петля; «мяч» — участок с NН₃-концевой группой; цНМФ — домен

С-конца, связывающий циклический нуклеотид (например, цГМФ); К_HA — домен, обогащенный гидрофобными (Н) и кислотными (А) остатками; Б — тетрамер из четырех α-субъединиц (вид сверху); В — модель тетрамера: стабилизация с помощью К_HA-домена; Г — схема активации/инактивации К⁺-канала Shaker-типа по модели «мяч на привязи»: R (rest) — состояние покоя, О (open) — открытое состояние, I — инактивированное состояние

Сегмент S4 отвечает за восприятие потенциала и контролирует активность канала. Его сенсорные свойства связаны с семью положительно заряженными остатками аминокислот. В субъ­единице этот домен (S4), реагирующий на изменения мембранного потенциа­ла, окружен другими трансмембранными участками, которые изолируют по­ложительный заряд (рис. 6.18, Б). Между 5-м и 6-м сегментами расположен особый домен — Н5 (helix), или Р (роге). Эта петля формирует часть водной поры и отвечает за проницаемость канала. Но мутации, затрагивающие струк­туру S6- и S4-S5-петель, показали, что эти участки цепи полипептида тоже связаны с К⁺-проницаемостью и/или чувствительностью канала к блокиру­ющим ионам. Функциональные участки находятся также на цитозольных N- и С-концах полипептидной цепи (рис. 6.18, А). Одна из моделей регуляции ак­тивности Shaker-канала предполагает наличие на N-конце домена («мяча»), осуществляющего открывание/закрывание канала (рис. 6.18, Г). Модель, на­званная «мяч на привязи», исходит из существования трех состояний канала: покой — R (rest); открытое — О (open) и инактивированное — I. При изменении потенциала в положительную сторону канал открывается (R→ О), что сопряжено с конформационными перестройками, а затем инактивируется вслед­ствие того, что NH₃-терминальная группа «мяча» перемещается в пору между

S5 и S6 сегментами субъединиц. На С-конце полипептида имеются домен цНМФ (cNMP), связывающий циклический нуклеотид монофосфат (цГМФ — воз­можный вторичный мессенджер, регулирующий активность канала), и домен взаимодействия К_HA, обогащенный гидрофобными

(Н — hydrophobic) и кис­лыми (А — acidic) остатками. К_HA-домены α-субъединиц отдельного канала или двух соседних каналов могут взаимодействовать, что будет стабилизиро­вать тетрамер (рис. 6.18, В) или приводить к образованию на мембране класте­ров из тетрамеров калиевых каналов.

Каналы вносят большой вклад в поступление ряда минеральных веществ, радиальный и дальний транспорт ионов в корне и распределение минеральных элементов в клеточных структурах, тканях и органах. Кроме того, каналы — неотъемлемые участники многих комплексных физиологических процессов, таких, как поддержание и регуляция потенциала на мембране, осморегуляция и солеустойчивость, устьичные движения, а также передача сигнала и ответ­ные реакции на разные внешние воздействия и др.