Пцр в реальном времени (Real-Time pcr)

Метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real-Time) стал одним из наиболее популярных методов в клинической генодиагностике и научных исследованиях [Godfrey T., et al., 2002].

Одна из наиболее значимых проблем ПЦР-диагностики – возможность получения ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами реакции. Исключение контаминации требует безукоризненного выполнения целого списка требований [Колупаев В.Е., 2002]. В условиях постоянного увеличения потока анализов вероятность контаминации из-за ошибок персонала непрерывно возрастает, а определение источника требует много времени и средств. Успехи флюориметрических технологий, разработка аппаратуры для измерения концентрации ампликонов непосредственно в ходе реакции. Позволили создать метод ПЦР в реальном времени [Higuchi R.,1993]. Внедрение этого метода в лабораторную практику позволило полностью отказаться от отдельного этапа регистрации, а также:

• Устранить угрозу контаминации специфическими продуктами реакции;

• Снизить строгие требования к организации лабораторного процесса;

• Сократить трудозатраты и время анализа;

• Проводить ПЦР-анализы в одном помещении.

Принцип метода – детекция одновременно с амплификацией. Он основан на измерении флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Это дает возможность оценить течение процесса, которое зависит от начального количества исследуемого генетического материала. Было показано, что в сравнении с другими количественными методами ПЦР- диагностики ПЦР в реальном времени является наиболее эффективной и наименее трудоемкой методикой [Bustin S.A., 2000]. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие методы:

1.Интеркалирующие красители. Этот способ детекции основан на том, что флюоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двойную цепь молекулы ДНК. Добавление этих красителей в реакционную смесь позволяет наблюдать за накоплением продуктов амплификации непосредственно во время реакции.

2.ДНК-зонды. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флюоресцентная метка и гаситель флюоресценции. Когда зонд находится в растворе, гаситель поглощает излучение и свечение отсутствует. В ходе ПЦР происходит присоединение ДНК-зонда к комплиментарной цепи ДНК, одновременно разъединяются флюоресцентная метка и гаситель, что приводит к увеличению детекции свечения. Чем больше ампликонов было наработано в данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.

Оборудование.

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный прибор, который состоит из трех блоков: амплификатора (термического блока), флюоресцентного детектора и компьютера. Примеры реагентов: наборы реактивов производит ЗАО «Внедрение систем в медицину» (Россия), «ЛабМетод» (Россия), «АмплиСенс» (ЦНИИЭ МЗ РФ).

Оценка резистентности микроорганизмов к антимикробным химиопрепаратам Автоматизированные системы

Наличие аппаратного обеспечения позволяет с помощью программы BACT в автоматизированном режиме определить антибиотикочувствительность выделенных штаммов двумя методами:

1). С количественной регистрацией результатов – определение минимальной ингибирующей концентрацией (МИК);

2). Полуколичественной регистрацией результатов – ТПК (тест пограничных концентраций).

Использование автоматизированной системы позволяют получать результаты антибиотикочувствительности через 6 часов от момента выделения чистой культуры, заменить малопроизводительный ручной труд.

В целях снижения расходов дорогостоящих антибактериальных препаратов и исключения бесконтрольного применения антибиотиков рационально использовать анализаторы определения резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам –“OSIRIS” ( “Sanofi Pasteue”,Франция), “Phoenix 100 System” (“Becton Dickinson”, США), “WaikAway 40(96)” (“DADE Intern.,I nc.”,США), “Bioscreen/iEMSreader” (“Labsystem”, Финляндия). Программное обеспечение позволяет выбирать препарат с учетом доз, путей введения и фармакокинетики.