Гибридизация днк или рнк

Принцип метода обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплиментарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Технически гибридизационные тесты сводятся к следующему. Одноцепочечный ДНК-зонд метится изотопом, ферментом или иной распознаваемой меткой. Исследуемый материал обрабатывают в режиме, позволяющем разрушить микроорганизмы, высвободить и денатурировать ДНК (т.е. расчленить её на одиночные нити). После инкубации зонда с исследуемым образцом измеряют количество меченой ДНК, связавшейся (вступившей в гибридизацию) с нуклеиновыми кислотами тест-препарата. Разновидности метода:

• Гибридизация на фильтре;

• Гибридизация в растворе;

• Гибридизация in situ.

В дальнейшем образцы исследуются методом ИФА, световой микроскопии.

Пример реагентов: исследование папилломавирусной инфекции методом гибридизации in situ- для его проведения применяют световой микроскоп, термостат, комплект реагентов для выполнения гибридизации, время исследования 2,5 часа («ЛабМетод», РФ).

Полимеразная цепная реакция (пцр)

Принцип метода: катализация ДНК-полимеразой многократного образования копий (амплификация) определенного участка ДНК. Этапы метода: термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки (30-40 с при 93-95⁰С), охлаждение среды и внесение праймеров, комплиментарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции используют синтетические праймеры – олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующих с окончаниями последовательностей и образующие последовательности 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag (по названию бактерии Thermus aquaticus)-полимеразу, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; термостабильность полимеразы обусловливает стабильность фермента и отсутствие необходимости в его повторном внесении. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом электрофореза. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести реакцию ДНК- гибридизации. ПЦР – высоко чувствительный метод.

В последнее время созданы и модификации ПЦР: ПЦР в сочетании с обратной транскрипцией; лигазная полимеразная реакция (использование ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы); прямая репликация рибосомальных РНК (при помощи РНК-полимеразы).

Примеры реагентов: 1. московский центр «Авиценна» предлагает наборы реагентов для обнаружения ДНК/РНК: HBV-ПЦР (ДНК вируса гепатита В); HBС-ПЦР (РНК вируса гепатита С); HSV-ПЦР(ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов); HHV- ПЦР(ДНК вируса герпеса человека 6 типа); HCMV-ПЦР(ДНК цитомегаловируса); HEBV-ПЦР(ДНК вируса Эпштейн-Барр); HPVgen-ПЦР(ДНК вируса папилломы всех типов); H.Pyl.-ПЦР(ДНК H.pylori); Ch.pn.-ПЦР(ДНК C.pneumoniae); Ch.T.- ПЦР (ДНК C.trachomatis); а также к уреаплазмам (Ur.Ur.- ПЦР) и микоплазмам (M.pn.- ПЦР; M.Hom.- ПЦР; M.Gen.- ПЦР), токсоплазмам (T.gon.- ПЦР), трихомонадам (T.vag.- ПЦР), гарднереллам (G.Vag.- ПЦР), нейссериям (N.Hon.- ПЦР), микобактериям (M. Tub.- ПЦР). 2. «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). 3. ЗАО «Внедрение систем в медицину».