Газожидкостная хроматография (гжх)

Газожидкостная хроматография в этиологической диагностике инфекций имеет две области практического применения. Наиболее распространено использование ее для идентификации анаэробных возбудителей на конечном этапе микробиологического анализа. Реже - выявление анаэробов в клиническом материале.

Для решения обеих задач могут использоваться две принципиально отличные методики хроматографического анализа.

І-я методика: извлечение определяемых характерных веществ из анализируемого объекта летучим растворителем с последующим вводом экстракта в хроматограф.

ІІ- методика: парафазного (head-spase) анализа. При данном анализе в хроматограф вводится не экстракт из анализируемого объекта и не сам объект, а находящаяся над ним и насыщенная летучими веществами паровая фаза. Обнаружение анаэробов в клиническом материале, как и идентификация чистых культур в микробиологических исследованиях. Основано на обнаружении специфических продуктов их метаболизма – летучих жирных кислот – пропионовой и нормальной и изомерной масляных, валериановой, капроновой, являющихся таксономическими признаками анаэробов. Материал, чаще экссудаты, из очага инфекции в количестве 1 мл помещают в стандартный пенициллиновый флакон, добавляют к нему равное по массе количество кристаллического калия бисульфата и закрывают пенициллиновой пробкой. В специальном патроне этот флакон нагревают в течение 5…10 мин до 90⁰С и затем присоединяют к блоку ввода пробы в хроматограф. Специальным дозатором паровая фаза над образцом вводится из флакона в хроматографическую колонку например отечественного хроматографа «Цвет-102» с ионизационно-пламенным детектором. Достоверность газохроматогрофического определения анаэробов при различных гнойно-септических процессах составляла 96% [Колесов А.П., Столбовой А.В., Кочеровец В.И., 1989].

С целью экспресс-диагностики генерализованных хирургических инфекций проводится определение летучих жирных кислот (ЛЖК) и глиоксиловой кислоты в биологических средах (кровь, ткани, отделяемое ран, пунктаты и т.д.). Соотношение и виды ЛЖК позволяют дифференцировать аэробную микрофлору от анаэробной, устанавливать вид микроорганизма. Продолжительность исследования составляет 1-1,5 часа [Карпищенко А.И., Элькин Г.И., 2000]. Широкое применение нашла автоматическая хемоиндикация на основе газожидкостного анализа жирных кислот бактерий и грибов (MIS Sherlock/GC 6890 HP, MIDI Inc.,США), позволяющая выявлять более чем 100 аэробных и анаэробных микроорганизмов.

Молекулярно-генетические методы

Приоритетными направлениями микробиологической диагностики являются генодиагностические технологии. Особенно они актуальны при идентификации штаммов, находящихся в не культивируемом состоянии. Перспективное направление генодиагностики – это биологические микрочипы, которые могут явиться технологией индикации широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, их антибиотикорезистентности в ходе анализа единичных клинических проб.

Двойная спираль ДНК построена из дискретных нитей, удерживаемых вместе водородными связями между собой комплиментарными основаниями (аденин-пурин; гуанин-цитозин). Водородные связи непрочные, и могут быть разделены при нагревании до 95-100⁰С, а при понижении температуры происходит их соединение по принципу комплиментарности, с образованием двухцепочечной нити ДНК (гибридизация). Этот процесс протекает только при генетической родственности пары. Из одной из нитей выделяют и искусственно синтезируют фрагмент (зонд), который будет взаимодействовать только с комплиментарной для себя последовательности ДНК-мишени. Это служит основой для проведения высокоточных и специфичных гибридизационных тестов. Наиболее распространены методы гибридизации ДНК или РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР).