Иммуноферментный метод

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на обнаружении иммунного комплекса антиген-антитело, один из компонентов которого (антиген или антитело) мечен ферментом, способным разлагать субстрат (хромоген) с образованием окрашенных продуктов. В настоящее время применяется твердофазная модификация ИФА – ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). В качестве твердой фазы используют лунки микропанелей. В большинстве случаев к твердой фазе присоединяются антитела, которые при инкубации с исследуемым материалом улавливают специфический антиген. К образовавшемуся при этом иммунокомплексу присоединяются затем меченные пероксидазой антитела, специфические то ли к его антигену, то ли к его антителу. В результате образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому ортофенилендиамина с Н₂О₂ , как хромогенного субстрата для пероксидазы, происходит пожелтение раствора. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются специальным спектрофотометром (иммуноферментный анализатор). В настоящее время в продаже имеются тест-системы на иммунохроматографической мембране для визуального определения результата. Время, затраченное на постановку ИФА, составляет 1-3 часа.

Примеры реагентов: тест-система ИФА для выявления HBs–антигена вируса гепатита В; тест-система ИФА для выявления антител к вирусу гепатита С; тест-система ИФА для выявления Jg G к вирусу гепатита D; тест-система ИФА для выявления антигенов ротавируса человека; РекомбиБест анти-ВГС; ВектоЦМВ-Jg M -стрип; ВектоЦМВ- Jg G -стрип; ВектоТоксо- Jg G –стрип; ВектоТоксо- Jg М –стрип; ВектоРубелла- Jg G –стрип (вирус краснухи); Лямблия-АТ-стрип; Таскар-стрип (токсокар); Тиатоп-стрип (описторхи); Тиатрис-стрип (трихинеллы); Тест-система ИФА для обнаружения О-антигена шигелл Зонне; Тест-система ИФА для определения антител к возбудителю туберкулеза; Тест-система ИФА для определения антител к грибам рода кандида; Тест-система ИФА для определения антител к грибам рода аспергиллус и др.

.

Радиоиммунологический анализ

Для проведения радиоиммунологического анализа (РИА) антитела или антигены метят радиоактивными изотопами и в зависимости от метода и целей исследования те или другие сорбируются на твердом носителе. Так, при конкурентном методе РИА в лунках полистироловых планшет сорбируются антитела. Затем к этим мобилизованным антителам прибавляют исследуемый материал, содержащий специфический к ним антиген. После образования иммунного комплекса антиген-антитело добавляют меченный ¹²⁵J антиген, обладающий той же специфичностью к иммобилизованным в лунках антителам. Внесенный меченный антиген будет реагировать лишь с той частью активных центром иммобилизованных антител, которые остались не заблокированными антигеном из исследуемого материала. В сравнении с контролем расход меченного антигена будет меньше, чем больше блокированы иммобилизованные антитела, на что укажет радиоактивность жидкой части реагируемой смеси. Для этих целей используют специальную радиометрическую аппаратуру.

Латексная агглютинация

Экспресс диагностика инфекционных возбудителей стала возможна и благодаря иммунологическому определению поверхностных антигенов микроорганизмов с помощью реакции латексной агглютинации.

Диагностические методы выявления некоторых тяжелых состояний, таких как септицемия, острые менингиты, должны максимально быстро давать точный и достоверный результат. Течение этих инфекций бывает чрезвычайно тяжелым, а исход летальным. Поэтому важно быстро поставить бактериологический диагноз, что позволит начать этиотропное лечение. Методы прямого микроскопического исследования за частую оказываются субъективными. Традиционные технологии выделения и идентификации выделенных штаммов микроорганизмов необходимы для определения их резистентности к антибиотикам, подтверждения диагноза, но они занимают значительный временной промежуток, могут давать и ложноотрицательные результаты, что связано с нарушением правил забора материала или началом антибиотикотерапии.

Иммунологические методы, определяющие наличие растворимых антигенов в клиническом материале (ликвор, моча, кровь, экссудаты и другие биологические жидкости), позволяют диагностировать инфекцию довольно быстро. Растворимые антигены, которые определяют в высоко специфических иммунологических реакциях, представляют собой полисахариды, специфичные для серогрупп и серовариантов микроорганизмов.

Одной из разновидностей иммунологических (серологических) реакций является высоко чувствительная и специфичная - реакция латексной агглютинации (РЛА).

Принцип метода: латексные частицы покрыты группами специфических иммуноглобулинов, полученных от иммунизированных животных, или моноклональными антителами. Перед постановкой реакции биологическая жидкость, в зависимости от растворимости исследуемого антигена, либо прогревается до 100⁰С, либо обрабатывается экстрагирующими ферментами для освобождения антигена. Реактивы, используемые в постановке РЛА, представляют собой взвесь латексных частиц. В присутствии достаточно высокой концентрации антигена в предварительно обработанной биологической жидкости латекс, сенсибилизированный специфичными к антигену антителами (иммуноглобулинами), вступает в реакцию агглютинации с антигеном и образует агрегаты, видимые невооруженным глазом.

Примеры тест-систем: фирма SANOFI PASTEUR (Франция) выпускает следующие наборы для РЛА- ASPERGILLUS (аспергиллы), CANDIDA (кандиды), CRYPTOCOCCUS (криптококки), MENINGITIDIS (для выявления менигококков А, B,C,W135: кишечной палочки, гемофилюс инфлюенса, пневмококков, стрептококков группы В), STREPTOCOCCUS B (стрептококки группы В), STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (пневмококки), YAEMOPHILUS INFLUENZAE B (гемофильная палочка), ROTAVIRUS (ротавирус), RUBELLA (возбудитель краснухи), STAPH PLUS ( стафилококки, в том числе MRSA), STREPTOCOCCUS A,B,C,D,F,G (стрептококки), PASTOREXV TOXO (токсоплазмы). Время затрачиваемое на проведение РЛА, подготовка к реакции и визуальная оценка, от 30 секунд до 20 минут.