4.Діагностика вірусних інфекцій

Основними досить поширеними методами діагностування вважається:

-Електронне мікроскопіювання

-застосування анти сироваток

-біотести (штучне ураження рослин)

4. 1 Способи встановлення інфекційності та методи діагностування вірусних хвороб пшениці

Хвороби, що викликаються вірусами за зовнішніми ознаками часто не відрізняються від хвороб, які виникли в результаті незбалансованого живлення або надмірної чи недостатньої кількості мі­неральних добрив, інших факторів, що не зв'язані з інфікуванням. Для встановлення інфекційності хвороби використовують різні способи та методи, які часто застосовуються і для ідентифікації збудників цих хво­роб.

Найшвидше можна провести діагностування за зовнішніми ознаками, що відносно просто і економічно вигідно. Однак, при цьому ми не за­вжди маємо можливість зробити остаточний висновок про вірусну природу даної патології. Цим методом можна користува­тись, відбираючи первинний інфекційний матеріал. Більш точно природу хвороби можна визначити шляхом біологічного тестування, застосовую­чи рослини-індикатори, за допомогою яких можна визначити не лише вірусну природу хвороби, але і встановити коло рослин-господарів збудника та виділити вірус із змішаних інфекцій. Засто­совуються і інші методи, які будуть висвітлені далі. Оскільки багато ві­русів може передаватися різними способами, то в деякій мірі це також характеризує властивості вірусу, а звідси може бути діагностичною ознакою.[20]

Інокуляція соком. Користуються цим способом в штучних умовах не лише з метою визначення інфекційної природи хвороби, а і з метою встановлення кола рослин-живителів. Для цього беруть молоді листки хворих рослин, добре промивають і товкачиком розтирають в ступці (краще у фарфоровій), додаючи трохи пережареного піску, а потім не­велику кількість води. Сік видавлюють через два шари марлі. Для стабі­лізації вірусу в соку до нього додають невелику кількість фосфатного буферу, який зменшує інактивацію вірусу і надалі сприяє кращому ура­женню. З цією метою можна також застосовувати сахарозу, декстрин, хлористий магній тощо.

Втирають сік в листок здорової рослини, (найчастіше проростка) ватним тампоном або шпателем (дерев'яна пластинка, обгорнута тонким шаром вати чи марлі). Останній змочують в соці, а потім набирають на нього трохи образиву (карборунд, мелене скло, вугільний пил, дрібний прожарений пісок). Листок, що заражаємо, розміщуємо на вказівному пальці лівої руки і легким рухом шпателя проводимо вздовж листка по його поверхні. Крізь подряпини з соком в рослину заноситься вірус. Після інокуляції рослини її поливають і ставлять під ізолятор. Через певний час у сприйнятливих рослин з'являються симптоми, які ідентичні тим, що були на хворих листках дослідних рослин, з яких брали сік. Проте це матиме місце лише тоді, коли для вірусу, що вивчається, при­таманна властивість передаватись механічно з соком.

Метод рослин-індикаторів (покажчиків) полягає в тому, що рослини окремих видів специфічно реагують на введення в них того чи іншого патогену, утворюючи некрози (відмерлі ділянки на листках).

Рослини-індикатори слід вирощувати ізольовано (під ізоляторами) на стерильному грунті, краще в теплицях. Більшість рослин-індикаторів спочатку висіваються в горщечки, які попередньо знезаражуються мар­ганцевокислим калієм в концентрації 5%. Встановлено, що рослини-індикатори чутливіші при температурі повітря 20-25°С і освітленні 8-10 тис. люкс. Такі рослини стають ще чутливішими, якщо їх витримати пе­ред зараженням 36-48 годин в темряві.

Для зараження слід використовувати молоді рослини (фаза 1-2 листки). Рослини-індикатори здебільшого заражують механічно шляхом натирання їх листків за допомогою шпателя соком, одержаним з дослі­джуваної рослини

Щоб зберегти інфекційність екстрактів, виготовлених з хворої рослини шляхом мацерації її тканин, застосовуються різноманітні бу­ферні розчини. Мацерацію тканин проводять в попередньо знезараже­ній ступці або гомогенізаторі. Як правило, рекомендується використову­вати фосфатний буфер від 0,1 до 0,01 М при рН 7,0-7,5, оскільки біль­шість вірусів інактивується при низькому знаменні рН. При цьому в го­могенат рекомендується додавати активоване вугілля. Для більш ефек­тивного пошкодження поверхні листків рослин індикаторів перед іноку­ляцією їх посипають абразивними речовинами (карборунд, целіт). Після проведення інокуляції (через кілька хвилин) інокулюм з поверхні лист­ків змивається водою, а рослини ставлять в затемнене місце на 12-24 години, щоб вони могли краще перенести наслідки зараження. Для більш швидкого одержання результатів треба застосовувати такі рослини-індикатори, які дають місцеву (локальну) реакцію. Якщо ж рослина-індикатор з місцевою реакцією не відома для даного передбачуваного вірусу, використовують рослини-індикатори з системною реакцією, на яких симптоми розвиваються на 7-10-й день після зараження.

Спостереження за рослинами-індикаторами треба починати через 1-2 дні після зараження і проводити протягом 4-х тижнів, а може, і біль­ше. Ознаки локальної (місцевої) реакції проявляються, як правило, че­рез 3-14 днів після інокуляції, системної — на 7-30-й день.

Рослинами-індикаторами можуть бути як культурні рослини, так і дикорослі (дурман, лобода гігантська, лобода , різні види тютюну тощо).

Серологічний метод діагностування вірусних хвороб. В основу цього методу покладено визначення вірусів з допомогою специфічних антиси-роваток. Застосовуючи його, можна відібрати безвірусний насіннєвий матеріал і легко виявити рослини-резерватори навіть при відсутності зовнішніх ознак на рослині.

Імуноферментний аналіз (ІФА) застосовується для ранньої діагнос­тики вірусів як в рослинах, так і в посівному матеріалі. При цьому, крім свіжого матеріалу, для аналізу можна використовувати заморожене і висушене листя. Серед різних модифікацій цього методу у фітовірусо-логії найбільше застосовуються такі з них: прямий, непрямий і сендвіч — методи твердофазного ІФА. На відміну від методу твердофазного ІФА, непрямий метод більш чутливий і дозволяє використовувати не-очищені вірусні препарати й нефракціоновані сироватки.

Визначається антиген шляхом прямої сорбції на нітроцелюлозних фільтрах при застосуванні комплексу пероксидаза-антипероксидаза (ПАП) і нітроцелюлози. Кількість антигену, що при цьому зв'язується з твердою фазою, пропорційна кількості сорбованого на ньому ПАП. До­даючи субстрат, який під дією ферменту, зокрема пероксидази, розкла­дається, можна виявити комплекс, що утворився в результаті цієї реак­ції. Внаслідок такої ферментативної реакції утворюється кольоровий продукт. Наявність кольорового забарвлення свідчить про присутність в матеріалі, що аналізується, вірусних часток. Оцінка результатів реакції проводиться візуально на основі різниці забарвлення контрольних і дослідних зразків.

Електронна мікроскопія. Існують різні варіанти електронного мікрос­копіювання.

Метод негативного контрастування.

Листок (чи іншу частину) рослини мацерують в ступці або на склі в краплі контрастера (розчин фос­форно-вольфрамової кислоти рН 7,4 в концентрації 2% або водний розчин уранілацетату в концентрації 2% при рН 7,4), а потім ця крапля наноситься на сітку-підкладку, на якій витримується 2-3 хвилини і відтя­гується шматочком фільтрувального паперу. Препарати висушують на повітрі і проглядають в полі електронного мікроскопа.

Метод занурення доцільно використовувати для виявлення нитчастих вірусів. Листок рослин зрізується і місце зрізу на 1-2 сек. занурюють у краплю дистильованої води, попередньо нанесеної на сітку-підкладку. Після висихання краплі препарат контрастується розчи­ном фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК), або водним розчином уранілацетату при експозиції 5-10 хв. Цей метод використовується при наявності в тканинах рослин високої концентрації вірусів.

Метод розбавленої суспензії. Листки рослин (шматочок площею 1 см) ретельно розтирають у фарфоровій ступці до тих пір, поки не утвориться однорідна маса, потім невеликими порціями до­дають 10-15 мл дистильованої води. Крапля цієї суспензії наноситься на сітку і контрастується так само, як і при проведенні аналізу методом занурення. Після цього препарат висушується і розглядається в полі електронного мікроскопа. Використовується цей метод, як і ті, про які йшлося, в тому випадку, якщо в клітинах рослини має місце висока концентрація вірусів.

Метод растрового (скануючого) мікроскопіювання застосовують для вивчення адсорбції окремих вірусів на клітині, дослідження їх орієнтації в розчинах та утворення вірусних кристалів. Він дає можливість виявити поверхневі діапазони об'єкта. Центрифугування в градієнті щільності дає можливість визначити такі фізичні велични, як молекулярна маса ві­русу, відносний вміст білка і нуклеїнової кислоти у віріоні, його коефі­цієнт седиментації.