Розділ 2. Матеріали та методи

У дослідженнях використовували самок білих безпородних щурів з початковою масою 40-50 г. Тварини були розміщені по троє в пластмасових клітках з піщаною підстилкою. Всього в експерименті було використано 120 тварин. Вода і їжа були доступні ad libitum. Всі тварини впродовж експерименту одержували напівсинтетичний раціон [37] позбавлений вітаміну А

Дослідні тварини були поділені на групи:

група І (+А/+А, контроль) – тварини, які до і після трансплантації карциноми Герена перебували на синтетичному раціоні із додаванням вітаміну А.

група ІІ (-А/-А) – тварини, які до і після трансплантації пухлини знаходились на раціоні, позбавленому вітаміну А.

група ІІІ (-А/+А) – тварини, які до трансплантації перебували на дієті, позбавленій вітаміну А. Починаючи з першого дня після трансплантації карциноми Герена тварини отримували фізіологічну дозу вітаміну А (щоденно 30 МО).

група ІV (-А/+АА) – тварини, які до трансплантації перебували на раціоні позбавленому вітаміну А. Починаючи з першого дня після трансплантації карциноми Герена отримували супрафізіологічні дози вітаміну А (щоденно 3000 МО).

група V (-А/+носій, дослідний контроь І) – тварини, які до трансплантації перебували на дієті, позбавленій вітаміну А. З першого дня після трансплантації карциноми Герена отримували олійний розчин.

група V (-А/+лРК) – тварини, які до трансплантації перебували на дієті, позбавленій вітаміну А. З першого дня після трансплантації карциноми Герена отримували ліпосомальну форму ретиноєвої кислоти у щоденній дозі 30 МО.

група V (-А/+РК, дослідний контроль ІІ) – тварини, які до трансплантації перебували на дієті, позбавленій вітаміну А. З першого дня після трансплантації карциноми Герена отримували ретиноєву кислоту у щоденній дозі 30 МО.

група VI (-А/+л, дослідний контроль ІІІ) – тварини, які до трансплантації перебували на раціоні позбавленому вітаміну А. Починаючи з першого дня після трансплантації карциноми Герена отримували ліпосоми без ретиноєвої кислоти.

Відбір тварин в експеримент проводили на 6-й тиждень їх перебування тварин на відповідному раціоні. Як модель злоякісного новоутворення використовували карциному Герена (штам пухлини наданий Інститутом експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України). Трансплантацію здійснювали на 6-й тиждень згодовування тваринам зазначеного раціону шляхом підшкірного введення в область стегна 0,4 мл 30 % суспензії пухлинних клітин у фізіологічному розчині. У тварин, які утримувалися на А-дефіцитній дієті розвивалися морфологічні ознаки А-авітамінозу [38], а саме: відсутність приросту маси тіла, або приріст менше 1 г впродовж 4-ох діб; зупинка росту; порушення зору при візуальній оцінці, зміни шерстяного покриву. Розвиток авітамінозу, ідентифікований за морфологічними параметрами, підтверджувався низким рівнем ретинолу сироватки крові дослідних тварин (< 0,35 мкмоль/л), визначений флуоресцентним методом [39].

Вітамін А вводили щоденно per os у вигляді олійного розчину ретинол ацетату [38]. Вітамін А у формі ретиноєвої кислоти у ліпосомній формі вводили через 24 години per os, починаючи із першого дня прививки пухлини в розрахунку 10 мкг ретиноєвої кислоти та 100 мг фосфоліпіду на 1 кг маси тварини. Бішарові ліпосоми готували із суміші спиртових розчинів фосфатидилхоліну і холестеролу [40]. Ступінь захоплення ретиноєвої кислоти, праналізований спектрофотометрично [41], складав 75 – 80 %.

Кінетичні параметри росту карциноми Герена визначали за критеріями величини росту пухлини і тривалості життя щурів [42, 20]. Величина росту карциноми Герена оцінювалась на основі зміни морфологічних показників, визначених за формулою: V = 0,4 ab², де а – більший діаметр пухлини, b – менший діаметр пухлини [42].

Евтаназію тварин проводили згідно міжнародних принципів Європейської конвенції «Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург, 1998) та норм біомедичної етики, відповідно до Закону України «Про захист від жорстокого поводження» (Київ, 2006).

Виділення мікросомної фракції

Тканини пухлини гомогенізували у скляному гомогенізаторі Поттера в 0,25 моль/л сахарозі. Гомогенат фільтрували через чотири шари марлі та центрифугували при 12000g протягом 15 хв. До надосадової рідини додавали іони Са²⁺ і Мg²⁺ (до 9 об′ємів надосадової рідини – 1 об′єм 80 ммоль/л розчину хлориду кальцію та 1 об′єм 160 ммоль/л хлориду магнію у 10 ммоль/л трис-НСІ буфері, рН=7,4). Проби перемішували протягом 10 хв на шейкері типу GFL-315 при 4^оС, при цьому вони значно мутніли. Після цього проби центрифугували 15 хв при 9000g [43]. Отриманий осад мікросомної фракції двічі промивали 0,25 моль/л сахарозою. Вихід мікросомної фракції тканин карциноми Герена складав в середньому 56 % відповідно.

Встановлення ступеня чистоти мікросомної фракції

Для встановлення ступеня забруднення виділеної мікросомної фракції домішками інших мембран, було визначено Na⁺,К⁺-АТФ-азну активність [44, 45], як специфічного маркера плазматичних мембран та сукцинатдегідрогеназну активність [46], як специфічного маркера внутрішньої мембрани мітохондрій. Згідно проведеним розрахункам, Na⁺,К⁺-АТФ-азна активність в мікросомній фракції пухлини та печінки становила 18% та 12%, а сукцинатдегідрогеназна активність 2,4% та 1,9% від загальної активності гомогенату пухлини та печінки відповідно, що свідчить про достатню чистоту виділеної мікросомної фракції.

Визначення n-гідроксилазної активності

Показником гідроксилазної активності цитохрому Р-450 може слугувати швидкість гідроксилювання аніліну, яку визначають за кількістю утвореного n-амінофенолу, що разом з фенолом, в присутності карбонату натрію, утворює індофенольний комплекс синього кольору [47]. Реакція відбувається на молекулі цитохрому Р-450 в присутності NADPH і кисню.

Реакцію розпочинали додаванням до інкубаційної суміші розчину аніліну до 0,03 моль/л кінцевої концентрації. Інкубаційна суміш об'ємом 1 мл містила 0,04 моль/л трис-НСІ буфер (рН=7,3), 16 ммоль/л розчин хлориду магнію, 3 ммоль/л NADPH і 2 мг білка мікросомної фракції. Дослідну і контрольну (NADPH вносили після припинення реакції) проби інкубували при 37 ^оС протягом 20 хв при постійному струшуванні. Реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл 15% розчину ТХО з наступним центрифугуванням при 3500g протягом 10 хв. До 1 мл надосадової рідини додавали 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію і 1,5 мл 2% розчину фенолу в розчині гідроксиду натрію з молярною концентрацією 0,2 моль/л. Проби витримували на водяній бані при 37^оС протягом 30 хв. Оптичну густину визначали спектрофотометрично при 630 нм з урахування коефіцієнту молярної екстинції для n–амінофенолу рівного 13,3 мМ^-1∙см^-1. n-Гідроксилазну активність виражали в нмоль/хв/мг білка.

Вміст білка визначали за методом Лоурі [48].

Визначення N-деметилазної активності цитохрому Р-450

Одним з показників гідроксилазної активності мікросом може бути швидкість деметилювання диметиланіліну (ДМА), яку визначають за кількістю утвореного формальдегіду [48]. Реакція проходить на молекулі цитохрому Р-450 в присутності NADPH і кисню. Реакцію починали додаванням до інкубаційної суміші розчину ДМА з молярною концентрацією 6 ммоль/л (готували на 0,05 моль/л розчині HCl). Інкубаційна суміш об’ємом 1 мл містила 0,04 моль/л трис- HCl буфер (рН=7,6), 16 ммоль/л розчин хлориду магнію, 3 ммоль/л розчин NADPH, 1,5 мг білка мікросом. Дослідну і контрольну (яка не містила NADPH) проби інкубували при температурі 37^оС протягом 30 хв при інтенсивному струшуванні. Реакцію зупиняли додаванням 0,25 мл суміші рівних об’ємів 25% розчину сульфату цинку і насиченого розчину гідроксиду барію. Для осадження білків проби центрифугували при 3500g протягом 10 хв. Вміст формальдегіду в надосадовій рідині визначали за допомогою кольорової реакції Наша [49]. Для цього до 0,5 мл над осадової рідини додавали 2 мл реактиву Наша в склад якого входить: 2 моль/л розчин ацетату амонію, 0,05 моль/л розчин льодяної оцтової кислоти, 0,02 моль/л розчин ацетил ацетону. Для утворення забарвлення проби витримували 45 хв на водяній бані при 37^оС. інтенсивність забарвлення реєстрували спектрофотометрично при 412 нм. Ферментативну активність обчислювали з урахуванням коефіцієнту молярної екстинції, рівного для формальдегіду 1,5 мМ^-1∙см^-1 і виражали в нмоль/хв/мг білка.

Визначення активності лактатдегідрогенази

Активності ЛДГ оцінювали за швидкістю утворення окисленого NAD, у реакції перетворення пірувату в лактат у присутності NADH+Н. При цьому швидкість утворення окисленого NAD прямопропорційна активності ЛДГ у пробірці. Ферментативну активність виражали у мккат/л [48].

Отримання ліпосом та включення в них ретиноєвої кислоти

Бішарові ліпосоми готували із суміші спиртових розчинів фосфатидилхоліну і холестеролу (мольне співвідношення 7:3 та 9:2) за методом [41]. РК розчиняли в 96% етиловому спирті і додавали до плівки ліпідів. Ступінь захоплення речовини ліпосомами аналізували спектрофотометрично [46]. Готові ліпосоми зберігали при температурі 4°С.

Статистична обробка результатів

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Місrosoft Ехсеl, використовуючи t-критерій Стьюдента. Вірогідними вважали результати, якщо Р < 0,05 [50].