Количественное определение дубильных веществ в лрс
В литературе имеется описание около 100 различных способов количественного определения дубильных веществ, которые можно подразделить на следующие основные группы:
1. ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЕ. Они основаны на количественном осаждении дубильных веществ желатиной, ионами тяжелых металлов (ацетат свинца) или адсорбцией гольевым порошком (обезжиренный кожный порошок).
Последний метод носит название весового единого метода (ВЕМ) и основан на способности фенольных соединений к связыванию с коллагеном.
Суть этого метода заключается в следующем: Из навески измельчённого сырья готовят водное извлечение.
В аликвоте его проводят определение экстрактивных веществ (по сухому остатку).
Другую часть извлечения медленно пропускают через колонку, наполненную предварительно промытым водой кожным порошком. Колонку тщательно промывают водой, после чего в полученном растворе также определяют содержание сухого остатка. По разнице рассчитывают количество фенольных соединений, которые связались с кожным порошком.
Известно, что не все фенольные соединения обладают способностью связываться с молекулами белка, т.е. обладают дубящим действием, однако они обладают биологической активностью.
Поэтому ВЕМ используют в основном в кожевенной промышленности для
оценки природных дубильных материалов.
ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ. Они основаны на реакциях с солями окисного железо-фосфорно-вольфрамовой кислотой, с реактивом Фолина-Дениса (ванадат аммония + фосфорномолибденовая кислота + фосфорная кислота).
ТИТРОМЕТРИЧЕСКИЕ. Они основаны на окислительных реакциях, прежде всего с использованием перманганата калия. Метод перманганатометрического титрования включен в X и X1 издания Государственной Фармакопеи. Это метод Левенталя в модификации А.Л. Курсанова, основанный на способности дубильных веществ значительно быстрее других фенольных соединений окисляться перманганатом калия в кислой среде.
Методика этого определения сводится к следующему: Экстракция дубильных веществ из навески измельчённого сырья проводится водой при нагревании.
Условия проведения этой стадия по ГФ Х и ГФ Х1 различны.
По ГФ Х процесс сводился к исчерпывающей дробной экстракции (до отрицательной реакции с раствором железо-аммониевых квасцов). Считалось, что таким образом это приводит к определению всей суммы дубильных веществ, присутствующих в ЛРС. По методу ГФ Х1 проводится однократная экстракция навески измельчённого сырья, причем режим экстракции очень напоминает способ приготовления отвара. Фармакопейные виды ЛРС, содержащие дубильные вещества, не используются для получения самих дубильных веществ, и предназначены для приготовления отвара, который и применяется как лекарственное средство. В этих условиях проводится определение не содержания дубильных веществ в сырье, а какую концентрацию дубильных веществ может обеспечить данное сырьё при правильном приготовлении отвара. Это довольно редкий в наше время пример того, что для обоснования фармакопейного метода количественного определения действующих веществ, кроме сокращения времени анализа принимают во внимание способ получения отвара, получаемого из ЛРС и используемого с медицинскими целями.
На стадии определения действующих веществ к аликвоте водного извлечения добавляют раствор индигосульфокислоты, в качестве индикатора, разбавляют смесь дистиллированной водой и титруют перманганатом калия до золотисто-желтого окрашивания.
Что же происходит в процессе титрования? Очевидно, что в процессе экстракции из ЛРС водой будут извлекаться не только дубильные вещества, но и другие водорастворимые соединения. Что же в данном случае титруется перманганатом?
Установлено, что различные фенольные соединения обладают разной реакционной способностью к окислению. При этом многоатомные фенолы окисляются значительно легче одноатомных. На способность окисляться у полифенольных соединений значительное влияние оказывает взаимное расположение фенольных гидроксилов.
Легче всего будут окисляться фенолы с мета-диоксигруппировкой и вицинальным расположением фенольных гидроксилов:
Пирокатехин Гидрохинон Резорцин
Пирогаллол Флороглюцин
Из этих структур, при титровании в первую очередь должны будут окисляться производные пирокатехина и пирогаллола, т.е. соединения, входящие в состав дубильных веществ. Окисление фенольных соединений протекает через промежуточное образование свободных радикалов, возникающих при отрыве одного атома водорода (феноксильные или ароксильные радикалы):
В конце титрования происходит окисление индигосульфокислоты до изатина и окраска реакционной смеси переходит от синей к золотисто-желтой.
Индигосульфокислота
Изатин
Для получения более точных результатов проводят "холостой" опыт, т.е. определяют сколько перманганата калия пошло на окисление индигосульфокислоты. Количество перманганата, пошедшего на титрование дубильных веществ, определяют по разности объемов титранта в первом и во втором случаях. При расчете содержания дубильных веществ в ЛРС используют коэффициенты пересчета на конденсируемые или на гидролизуемые дубильные вещества.
При оценке всех перечисленных методик ясно, что все они, из-за разнообразия строения фенольных соединений, являются лишь приблизительными, полуколичественными. С их помощью можно определить либо лишь часть фенольных соединений (ВЕМ, с желатином), либо всю сумму фенольных соединений (а не только относящиеся к танинам).
При перманганатометрическом титровании может происходить окисление не только фенольных соединений, имеющих вышеуказанное расположение фенольных гидроксилов (большинство флавоноидных соединений и др.), но и
некоторых не фенольных соединений, например аскорбиновой кислоты.
Таким образом, правильнее было бы назвать методику ГФ не "Определение дубильных веществ", а "Определение редуцирующих (восстанавливающих) веществ" или "Определение окисляемых веществ".