3.6 Эволюция сенсорной системы для определения альдегидоксидазы

Наряду с генным анализом, где микроаналитические системы (генные чипы — топологически кодированные матрицы распознающих площа- док) оказались в настоящее время наиболее эффективным инструмен- том, достаточно интенсивно развиваются и такие приложения, как бел- ково-пептидный анализ, протеомика, диагностический анализ.

Рассмотрим в качестве примера преобразования с учётом масштаби- рования в микроаналитическую систему метод определения альде- гидоксидазы (АО) с помощью хроматографии и фермент-субстратной реакции с выделением флюоресцирующего продукта, реализованной в проточном реакторе (рис. 3.7).

Рис. 3.7. Ферментативная реакция превращения коричного альдегида в флюоресцирующий продукт — коричную кислоту, катализируемая альдегидоксидазой

Определение АО традиционно проводят с помощью спектрофотометрии на основе измерения изменения оптичес- кого поглощения продукта реакции. В данном примере использованы также и флуоресцентные свойства продукта. Классическое использова- ние избирательной реакции для определения аналита в многокомпонен- тном образце может быть реализовано, как показано на рисунке 3.8 путем ионообменного хроматографического разделения сложного объекта и «одновременной» регистрации полного профиля элюата с помощью универсального УФ детектора и избирательного детектирования аналита с помощью фермент-субстратной реакции.

Рис. 3.8. Схема экспериментальной установки для определения АО в экстракте печени с помощью ионообменной хроматографии и пост-колоночной фермент-субстратной реакции с коричным альдегидом (А), совмещенная запись ионообменной хроматограммы экстракта, с помощью УФ детектирования (1) и при избирательном детектировании АО (2) (Б) и запись хроматограммы по выходу флюоресценции с введением внутреннего стандарта — зон коричной кислоты

Такой формат можно определить как прототип сенсорной системы, с тем отличием, что в сенсорной системе распознающий элемент, как правило, иммобилизован.

Для масштабирования этого метода в условиях микроаналитичес- кой системы, работающей в непрерывно-циклическом режиме, можно изготовить устройство, представленное на рисунке 3.9. Представленная микроаналитическая система может быть изготовлена из оптически прозрачного диэлектрика с оптическим доступом для регистрации вы- хода белкового экстракта универсальным УФ детектором и выхода аль- дегид оксидазы с помощью флуориметрического детектирования ко- ричной кислоты. На рисунке 3.10 представлены отдельные модули кон- струкции биочипа.

Рис. 3.9. Схема гибридно-интегрального микроаналитического устройства (биочипа) для определения альдегид оксидазы в экстракте печени

Представленная микроаналитическая система (биочип) работа- ет следующим образом. Образец экстракта в виде твердого образца температурой жидкого азота помещается во входной порт биочипа, содержащий микронагревательный элемент для экспрессного раз- мораживания образца и картридж для обессоливания пробы. Обес- соленный продукт поступает в сепарационный канал, где разделяет- ся на фракции методом капиллярного электрофореза. Выходящие фракции детектируются универсальным фотометрическим детекто- ром при длине волны 280 нм.

Рис. 3.10. Функциональные элементы микроаналитической системы (биочипа) для определения альдегид оксидазы в белковых экстрактах: А — входной порт с микронагревателем и картриджем для обессоливания; Б — флуориметрический модуль

Далее элюат соединяется с субстратом, диффузионно смешивается с ним и поступает в детекторную зону флюориметра, где регистрируется интенсивность флюоресценции продукта реакции.

Как видно из рисунка 3.10 биочип является гибридно-интегральным устройством, то есть содержит как интегрированные элементы, так и навесные. Интегрированными элементами являются рельеф на под- ложке, металлизация для изготовления ламелей электрических комму- никаций, планарные световодные каналы для организации фотометри- ческого детектирования. Гибридными навесными являются входной порт, источники и приемники излучения, оптические элементы.