2.6.4. Биосенсоры с иодид-селективными электродами

Определение глюкозы. Как уже говорилось, в присутствии глюкозооксидазы глюкоза окисляется с образованием перекиси водорода. Если в смеси при этом присутствуют пероксидаза и йодид-ионы, то перекись водорода идет на окисление последних с образованием йода.

По скорости потребления иодид-ионов, измеряемой с помощью иодид-селективного электрода, можно судить о концентрации Н₂0₂, а значит, и глюкозы.

Определение фенилаланина. В биосенсоре для определения фенилаланина на поверхности йопид-селективного электрода в полиакриламидном геле иммобилизована L-аминооксидаза (L-AO) и пероксидаза. Принцип работы этого биосенсора сходен с предыдущим.

Впрочем, он менее селективен, чем биосенсор на основе аммиакчувствительного электрода.

Определение эстрадиола. Определение эстрадиола проводят с помощью конкурентного иммуноанализа с применением йодид-селективного электрода. На поверхности электрода адсорбирована желатиновая мембрана с иммобилизованными в ней антителами против 17(3-эстрадиола. Электрод помещают в раствор, в котором присутствует смесь свободного эстрадиола и эстрадиода, меченного пероксидазой (рис. 5.5а). Чем меньше концентрация свободного эстрадиола, тем больше меченного эстрадиола связывается с мембраной. При добавлении в раствор Н₂0₂ и I^- в качестве субстрата пероксидазы в мембране электрода происходит ферментативное окисление йодид-ионов с образованием йода. При этом возникающий на йодид-селективном электроде потенциал пропорционален количеству связанной пероксидазы, а значит, обратно пропорционален логарифму концентрации эстрадиола (рис. 2.19).

Рис. 2.19. Определение 17-эстрадиола с помощью йодид-селективного электрода:

а) схема анализа;

б) калибровочная кривая, отражающая зависимость электродного потенциала от концентрации аналита

2.6.5. Биосенсоры с Аg2s-чувствительными электродами

Определение цистеина. Определение цистеина с помощью Ag₂S-чувствительных электродов может быть основано на неферментативном восстановлении цистеина и цистин, который образует с ионами Ag⁺ нерастворимый сульфид.

Более специфичное определение цистеина основано на его восста- новлении под действием р-цианоаланинсинтетазы:

Однако в этом случае цианидионы создают помехи на электроде.

2.6.6. Амперометрические биосенсоры

Определение глюкозы. Примерно в половине статей, посвященных разработке биосенсором, описываются биосенсоры для определения глюкозы. Дело тут не только в клинической значимости подобного анализа. Накопленный опыт позволяет на примере определения глюкозы сравнивать разные типы сенсоров и оценивать новые разработки.

Основные способы получения аналитического сигнала в глюкозных биосенсорах суммированы на рисунке 2.20. Все они основаны наиспользовании глюкозооксидазы.

Рис. 2.20 Способы получения аналитического сигнала при окислении глюкозы глюкозооксидазой (GOD)

I. В качестве продукта реакции окисления глюкозы образуется глюконовая кислота, что дает возможность в качестве аналитического сигнала использовать изменение рН:

2. В некоторых типах электродов может происходить реокисление восстановленной формы глюкозооксидаз:

Это позволяет использовать в качестве аналитического сигнала величину анодного тока.

3. В ходе окисления глюкозы потребляется кислопод:

По уменьшению его концентрации, определяемой с помощью элек- трода Кларка, можно определять концентрацию глюкозы.

4. Если катод в электроде Кларка сделать анодом, поменяв поляр- ность включения электрода-трансдьюсера, то при потенциале +0,6 В будет происходить окисление перекиси водорода:

5. Образующаяся при окислении глюкозы перекись водорода в присутствии пероксидазы (РО) окисляет йодид-ион до йода. В этом случае концентрацию глюкозы можно определять, измеряя концентра- цию йодид-иона с помощью йодид-селективного электрода:

6. В качестве окислителя можно использовать не кислород, а меди- итор, например, ферроцен (Fc):

Определение лактата. Содержание лактата в крови — важный показатель интенсивности мышечной деятельности. В основе определения лактата биосенсорами могут лежать четыре разные реакции. В двух из приведенных ниже примеров в качестве окислителя лактата выступает кислород, а в двух другихмедиаторы.

Определение холестерина. Полагают, что повышенный уровень холестерина в крови коррелируетс риском ишемической болезни сердца.

Биосенсоры на холестерин могут быть основаны на использовании именно таких пар ферментов. В одном из них (рис. 2.21) задействована система сопряжения, включающая NAD⁺/NADH, диафоразу и ферро цен в качестве медиатора. В другом (рис. 2.22) используется система е пероксидазой и ферроценом. Наконец, в третьем биосенсоре используется тонкая электрохимическая ячейка, в которой происходит прямой перенос электронов с холестериноцсидазы на ферроцен.

Рис. 2.21. Система сопряжения в биосенсоре на холестерин, включающая NAD⁺/NADH, диафоразу и ферроцен в качестве медиатора:

1) холестеринэстераза;

2) холестериндегидрогеназа

Рис. 2.21. Система сопряжения в биосенсоре на холестерин, включающая окисление холестерина кислородом с образованием перекиси водорода, пероксидазу и ферроцен:

1) холестеринэстераза;

2) холестериноксидаза

Определение фосфата. Для определения фосфата также можно воспользоваться глюкозным биосенсором. В основе метода лежит тот факт, что фосфат ингибирует щелочную фосфатазу (АР) - фермент, катализирующий превращение глюкозо-6-фосфата в глюкозу.

Таким образом, сравнивая количество образующейся глюкозы в отсутствие и в присутствии ингибитора, можно определить концентрацию фосфата.

Определение крахмала. Разработан биосенсор для определения крахмала, схема которого представлена на рисунке 2.23.

Рис. 2.23. Схема работы двухмембранного биосенсора для определения крахмала с элиминацией свободной глюкозы: аА — а-амилаза; GOD — глюкозооксидаза; С — каталаза; GA — глюкоамилаза

Сенсор основан на измерении концентрации перекиси водорода, образующейся при окислении глюкозы кислородом в присутствии глю- козооксидазы. Для того чтобы понять, как работает биосенсор, рас- смотрим показанные на рисунке ферментативные процессы. Под дей- ствием а-амилазы крахмал разрушается с образованием декстринов и мальтозы. Мальтоза же под действием иммобилизованной в биосенсо- ре глюкоамилазы превращается в глюкозу, которая затем и окисляется глюкозооксидазой с образованием перекиси водорода.

Биосенсор сконструирован таким образом, чтобы устранить помехи, создаваемые глюкозой, присутствующей в качестве примеси в опре- деляемом растворе. Для этого в биосенсоре имеются две мембраны. Глюкоамилаза и глюкозооксидаза иммобилизованы с внутренней сто- роны первой мембраны в приэлектродном пространстве. С внутренней стороны второй мембраны иммобилизованы глюкозооксидаза и ката- лаза. Первый из ферментов катализирует окисление глюкозы, попада- ющей в межмембранное пространство, а второй — окисление перекиси водорода с образованием кислорода. Таким образом, ни глюкоза, ни перекись водорода в качестве примесей не попадают в приэлектродное пространство.

Определение этанола. Для определения уровня этанола в крови разработано несколько типов биосенсоров.

В одном из них в качестве биологического материала используется суспензия бактерий — Acetobacter xylinium или Trichosporon brassicae. Оба вида бактерий катализируют аэробное окисление этанола в уксусную кислоту:

За реакцией следят с помощью кислородного электрода. В биосен- сорах описанного типа, разработанных в Японии, бактерии иммобили- зованы методом капсулирования. Линейный диапазон подобных биосенсоров составляет 5—72 мМ.

В биосенсорах другого типа окисление этанола в уксусную кислоту происходит под действием алкогольдегидрогеназы (ADH), а электроны переносятся на электрод через систему сопряжения, включающую пары NAD'/NADH и [Fe(CN)₆]³7[Fe(CN)₆]⁴ (рис. 2.24).

Рис. 2.24. Схема сопряженных реакций в биосенсоре для определения этанола, включающая алкоголь- дегидрогеназу, систему NAD⁺/NADH и [Fe(CN)₆]³-^/4-

Определение аспирина. Аспирин оказывает терапевтический эффект, когда его концентрация и крови составляет 1,1 —1,2 мМ.

Традиционно уровень аспирина контролируют спектрофотометры по образованию окрашенного комплекса салициловой кислоты с Fe³⁺. (В салициловую кислоту аспирин превращается в организме под действием эстераз печени).

Однако этот метод неспецифичен. Другой метод определения сали циловой кислоты основан на ее специфическом окислении в катехол п присутствии бактериального фермента — NADH-зависимой салит i латгидроксилазы. На основе этого метода автором данной книги разра батывается биосенсор, в котором катехол окисляется на печатном грл фитовом электроде.

Рис. 2.25. Гидролиз ацетилсалициловой кислоты (аспирина) и последующее превращение салициловой кислоты в катехол под действием салицицилатгидроксилазы

Определение парацетамола (н-ацетил-п-аминофенола). Парацетамол сегодня широко употребляют в качестве обезболивающегоЦ| средства. Однако его передозировка ведет к необратимому поражению печени. По этой причине необходимо иметь метод быстрого опре- деления концентрации парацетамола в крови, для чего очень удобно было бы использовать биосенсор. В принципе парацетамол может лег- ко окисляться на угольно-пастовом электроде, но такой электрод сам но себе неселективен. Для придания ему селективности можно исполь- юпать фермент арилациламидазу, который катализирует превращение парацетамола в п-аминофенол. Последний может окисляться на элек- троде в хинонимин при значительно меньшем потенциале, чем сам па- рацетамол. В качестве электрода в этом случае можно использовать пе- чатный графитовый электрод. Схема реакций, иллюстрирующая оба способа определения парацетамола, представлена на рисунке 2.26.

Рис. 2.26. Определение парацетамола: