1. Материалы, реактивы и оборудование

1.1 0,5%-ный раствор желатина; 0,1н раствор уксусной кислоты; 0,1н. раствор уксуснокислого натрия; 96%-ный этиловый спирт; пробирки обыкновенные; мерные пипетки на 2 мл; цилиндры на 25 мл.

1.2 Неразбавленный яичный белок; насыщенный раствор сернокислого аммония; сернокислый аммоний, тонко растертый порошок; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор сернокислой меди; пробирки обыкновенные; мерные пипетки на 5 мл; воронки, бумажные фильтры.

1.3 Раствор яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония (см. приложение Б, п.5); 10%-ный раствор хлористого бария; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор медного купороса; 10%-ный раствор хлористого аммония; сернокислый аммоний, тонко измельченный; пробирки обыкновенные; целлофановый или коллодиевый мешочек; химический стакан или сосуд на 1–2 мл; пипетки мерные на 10 мл; пипетки.

2 Общие положения

2.1 Определение изоэлектрической точки белков

Белки, благодаря присутствию в их составе аминных и карбоксильных групп, существуют в растворах в виде заряженных частиц.

В зависимости от количества в белке аминных и карбоксильных групп его молекула в водном растворе приобретает положительный или отрицательный заряд. Большинство белков животного происхождения содержат в своем составе больше дикарбоновых аминокислот и поэтому они заряжаются отрицательно (белки-анионы). Некоторые белки содержат в своем составе значительные количества диаминокислот и поэтому заряжаются положительно (белки-катионы). Одноименный заряд молекул способствует взаимному отталкиванию частиц, что обеспечивает устойчивость их в водном растворе.

Число ионизированных групп в белке может быть увеличено или уменьшено при изменении рН среды. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильных групп, и отрицательный суммарный заряд белковой молекулы уменьшается. Наоборот, в щелочной среде подавляется ионизация аминных групп, и положительный суммарный заряд белка уменьшается. При определенном значении рН число положительных зарядов на поверхности белковой молекулы будет равным числу отрицательных зарядов, и в целом заряд частицы белка станет равным нулю. Состояние белка, при котором суммарный заряд его равен нулю, называется изоэлектрическим состоянием. рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, обозначается рl. В изоэлектрической точке за счет равенства зарядов ослабляются силы отталкивания между белковыми частицами, что благоприятствует агрегации белковых молекул и выпадению белка в осадок, т.е в изоэлектрической точке раствор белка неустойчив, белок теряет один из факторов стабилизации - заряд.

При добавлении щелочи или кислоты к белку, выпавшему в осадок в изоэлектрическом состоянии, наступает перезарядка его молекул, и белок вновь растворяется.

Принцип метода. В нескольких пробирках с помощью ацетатных буферов создают растворы с различными значениями рН среды. Затем во все пробирки добавляют гидрофильное соединение, отнимающее у белка гидратную оболочку, удерживающую его в растворе. По пробирке с наиболее обильным осадком белка определяют значение рН, соответствующее изоэлектрической точке.

Ход работы. Для определения изоэлектрической точки желатина в пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты, уксуснокислого натрия, раствора желатина и этилового спирта в соотношениях, указанных в таблице 1. После перемешивания в каждой пробирке раствор имеет определенное значение рН и степень мутности. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу1.

Таблица 1  Основные параметры опыта и его результаты

№ проб.	Состав буферной смеси, мл		рН смеси	0,5% р-р желатина,мл	Этиловый спирт,мл	Степень мутности
	0,1 н СН3СООН, мл	0,1н Н3СООNa мл
1	1,8	0,2	3,8	1,0	4,0
2	1,4	0,6	4,4	1,0	4,0
3	1,0	1,0	4,7	1,0	4,0
4	0,6	1,4	5,1	1,0	4,0
5	0,2	1,8	5,7	1,0	4,0

В графике «степень мутности» отсутствие осадка обозначают знаком (-), наличие осадка – знаком (+), значительное помутнение – несколькими плюсами.

ВЫВОДЫ