Фиксация молекулярного азота микроорганизмами в симбиозе с растениями.

Известно, что бобовые растения способны обогащать почву азотом. Древнеримский уче­ный М. Т. Варрон за 37 лет до н. э. писал: «Бобовые ра­стения надо сеять на легких почвах не столько ради их урожая, сколько той пользы, которую получают после­дующие сельскохозяйственные культуры». Долгое время люди не могли разгадать секрет увеличения азота в поч­ве после бобовых. В 1838 г. французский ученый Ж - Б. Буссенго, выращивая на одной и той же почве кле­вер, горох и пшеницу, установил, что бобовые культуры росли не только лучше пшеницы, но и накапливали большое количество азота. Необычным было и то, что содержание азота в бобовых растениях значительно пре­вышало его количество, которое они могли получить из почвы и воды.

В 1886 г. русский ученый М. С. Воронин в одной из своих работ описал бактерии, обнаруженные им в клу­беньках, и высказал предположение об их непосредст­венной связи с образованием клубеньков. Выделить бак­терии из клубеньков в чистую культуру удалось в 1888г. М. Бейеринку. Он назвал их Bact. radicicola. Вскоре пос­ле этого такие же бактерии из клубеньков выделил Б. Франк и дал им название Rhizobium, которое и приня­то в настоящее время. Была установлена способность микробов в симбиозе с бобовыми фиксировать молеку­лярный азот. Это было великое открытие XIX в. К. А. Ти­мирязев по этому поводу писал: «Едва ли в истории найдется много таких открытий, которые были бы таким благодеянием для человечества, как включение клевера и вообще бобовых растений в севооборот, так порази­тельно увеличивших производительность труда земле­дельца» (Избр. труды. — М.: Огиз-сельхозгиз, 1948, т. II, с. 148). По расчетам некоторых исследователей (Е. Н. Мишустии с соавт., 1983), примерно около 70% азота, который растения берут из почвы, накоплено био­логическим путем. Такой азот не только дешев, но и безвреден. Велика роль в этих процессах микроорганизмов, находящихся в клубеньках бобовых растений.

Характеристика клубеньковых бактерий (ризобий). Клубеньковые бактерии могут быть овальной, палочко­видной или разветвленной (бактероиды) формы. Палоч­ковидные формы обычно слегка изогнуты. У клевера они более толстые и короткие, у гороха и вики — длиннее. Клубеньковые бактерии люпина и фасоли более изогну­тые. В молодом возрасте клетки подвижные, причем количество жгутиков и их расположение у медленно- и быстрорастущих бактерий разные. Медленнорастущие — монотрихи, быстрорастущие — перитрихи. Клубеньковые бактерии хорошо окрашиваются эритрозином и метиленовым голубым. По Граму не окраши­ваются. Из всех форм наибольший интерес представля­ют разветвленные (бактероиды), они появляются при старении культуры, не способны размножаться, но с их появлением фиксация азота из воздуха возрастает.

По скорости роста на питательных средах клубенько­вые бактерии делят на две группы: 1) быстрорастущие {колонии на плотных питательных средах появляются через четверо суток), к ним относятся клубеньковые бактерии гороха, клевера, люцерны, кормовых бобов, вики, чины, донника, фасоли и др.; 2) медленнорасту­щие, их размножение происходит в 2 раза медленнее, колонии появляются на 7—8-е сутки. Такие бактерии со­держатся в клубеньках люпина, сои, арахиса, сераделлы и других растений.

Растут клубеньковые бактерии на маннитном агаре, образуя на поверхности среды колонии белого цвета слизистой консистенции. Колонии медленнорастущих культур мельче, чем быстрорастущих. Каждое бобовое растение имеет свои клубеньковые бактерии.

В клубеньках бобовых могут содержаться активные и неактивные штаммы бактерий. Если клубеньки мелкие, то в них чаще встречаются неактивные штаммы, то есть такие, которые вместе с бобовыми плохо усваивают ат­мосферный азот. Они характеризуются высокой виру­лентностью. Кроме того, образование большого количе­ства клубеньков не только не способствует усвоению азота, но они сами используют тот азот, который расте­ние получает из почвы, то есть ведут паразитический образ жизни. Рост растений с большим количеством мелких клубеньков угнетается. Среди бобовых имеются и такие, которые не образуют клубеньки на корнях. Они составляют примерно около 9% общего количества бо­бовых.

При образовании меньшего количества крупных ро­зовых клубеньков растения получают больше азота, по­вышается урожай. Розовый цвет ткани клубенька обус­ловливает содержание в нем леггемоглобина — гемогло­бина бобовых растений. Такой пигмент в клубеньках сои обнаружен в 1939 г. японским исследователем X. Кубо. Он образуется только в симбиотической систе­ме клубеньковые бактерии — растение. Вне симбиоза клубеньковые бактерии и бобовые растения не синтези­руют гемоглобин. В связи с этим его рассматривают как фактор, принимающий участие в симбиотической фикса­ции азота. По-видимому, гемоглобин превращает гидроксиламин в аммиак, выполняет роль переносчика и ре­гулятора кислорода в симбиотической системе. Бобовые растения в симбиозе с клубеньковыми бактериями спо­собны фиксировать в среднем до 200 кг азота на 1 га почвы, причем 2/3 его берут из воздуха и 1/3 — из ми­неральных соединений почвы.

Первый стабильный продукт биологической азотфиксации — аммиак. Он образуется в результате повышения активности инертного азота ферментом нитрогеназой и последующего соединения его с водородом. Нитрогеназа — специфический ферментативный комплекс, состоя­щий из двух белков: в один из них входят молибден и железо, в другой — только железо. Обязательный ком­понент азотфиксирующей системы — негеминовый желе­зосодержащий белок ферредоксин, который служит до­нором электронов, то есть восстановителем. Для восста­новления одной молекулы азота затрачивается 12 молекул АТФ. Реакция идет по схеме N2+3H₂+ 12 ATФ→2NH₃+ 12 АДФ + 12 ФН. Аммиак соединяется с кетокислотами бактерий, которые превращаются в аминокислоты, используемые затем растениями. Фикса­ция молекулярного азота происходит в видоизмененных клубеньковых бактериях— бактероидах.

Формировать клубеньки и фиксировать азот воздуха в симбиозе с другими микроорганизмами могут и небо­бовые растения. На корнях некоторых из них (ольха, облепиха, береза, хвойные) имеются образования, подоб­ные клубенькам бобовых, в которых симбионтами явля­ются не бактерии, а грибы. По эффективности фиксации

молекулярного азота такие растения не уступают бобо­вым. Следовательно, микроорганизмы могут фиксировать азот из воздуха в симбиозе не только с бобовыми, но и другими растениями.

Нитрагин. Наблюдения показали, что бобовые растения дают высокий урожай и обогащают почву азотом в том случае, если на корнях имеются крупные клубеньки. Бобовые плохо растут на поч­вах, где впервые культивируются и где нет соответствующих клу­беньковых бактерий. Это обстоятельство привело к попытке обога­тить ими почву. Наиболее простой метод обогащения почвы клу­беньковыми бактериями — перенос земли с поля, на котором бобо­вые давали хороший урожай. Подобные опыты были проведены в 1887 г. Сальфельдом на опытной станции в Бремене (Германия). Установлено, что на почве из-под бобовых урожай был значитель­но выше, чем в контроле, где отсутствовали клубеньковые бакте­рии. В дальнейшем обогащение почвы бактериями проводили путем рассева земли из-под бобовых. Такой метод очень трудоемкий, так как требовалось переносить большие количества земли, притом он и небезопасен в смысле распространения фитопатогенных микроор­ганизмов и семян сорных растений. Все это требовало разработки других, более совершенных методов инокуляции. Лучшим оказался метод использования чистых культур клубеньковых бактерий.

Впервые бактериальный препарат был изготовлен в 1896 г. Ф. Ноббе и Л. Гильтнером (Германия) и назван нитрагином. И Рос­сии подобная работа (1907) была проведена Л. Т. Будиновым. Мас­совое производство нитрагина в пашей стране начато в 1929 г., ког­да была получена первая крупная партия препарата, которую вно­сили под сою. С этого времени начинают создаваться первые спе­циальные производственные лаборатории для изготовления бактерналыюго удобрения, а затем и заводы.

Микробиологическая промышленность выпускает две формы нит­рагина: ризоторфин и ризобин - Ризоторфин представляет собой смесь клубеньковых бактерий со стерильным торфом. Культуру клубень-конь: бактерий, предназначенную для определенного вида бобового растения, вначале выращивают на агаризованной среде, в состав которой входит отвар семян бобовых и 1% сахарозы. Полученную лабораторную культуру вносят за)ем в производственный ферментер и культивируют в течение 50—70 ч при температуре 28—30°С в аэ­робных условиях, для чего в среду (рН 6,5—7,2) подают стерильный воздух. В процессе культивирования численность микробных клеток в 1 мл среды возрастает до 1 млн. Такую культуру смешивают со стерильным торфом.

Наполнитель высушивают, размалывают, нейтрализуют СаСО3, помещают в полиэтиленовые пакеты, которые запаивают и стерили­зуют у-лучами. В такой пакет стерильной иглой вводят инокулят. Отверстие в пакете заклеивают липкой лентой. Содержимое тща­тельно перемешивают и выдерживают и течение 2—4 недель при 26°С. За это время численность клубеньковых бактерии резко возрастает.

Ризобин (сухой нитрагин) представляет собой высушенную куль­туру клубеньковых бактерий с наполнителем. Клетки бактерий от сре­ды отделяют сепарированием, после чего к ним добавляют защитную среду (20% мелассы и 1% тиомочевины) и высушивают под вакуумом при температуре 30—35°С. Сухую биомассу (влажность 2—5%) раз­малывают, смешивают с наполнителем (бентонит) и фасуют в вла­гозащитные мешки. В 1 г препарата должно быть не менее 9 млрд. жизнеспособных клубеньковых бактерий.

Список литературы

Ассонов Н.Р. «Микробиология» - 2-е изд.- М.: Агропромиздат, 1989.

Колычев Н.М., Госманов Р.Г. «Ветеринарная микробиология и иммунология» - М.: КолосС, 2006.

12