Лабораторная диагностика возбудителя эрлихиоза собак.

Основанием для постановки предварительного диагноза служат данные анамнеза и характер симптоматики болезни. Окончательный диагноз ставят в лаборатории после выявления возбудителя или его нуклеиновой кислоты в патологическом материале, а также ретроспективно по сероконверсии к E. canis. Результаты цитологического и гематологического исследований крови, а также исследования аспирированного материала костного мозга животных на разных стадиях болезни предоставляют ценную в диагностическом плане информацию.

Обнаружение возбудителя.

Прижизненно. Паразитемия обычно интенсивна только в период лихорадки, когда уровень инфицирования моноцитов достигает 4% - начиная с третьей недели болезни. В субклинический период обнаружить возбудителя в клетках крови удается редко. Для обнаружения возбудителя в крови микроскопируют окрашенные мазки крови, а также клеточную фракцию крови, осажденную обычным центрифугированием. Мазки крови окрашивают по Романовскому-Гимзе. При окраске по Романовскому-Гимзе обнаруживают характерные окрашенные в пурпурный цвет морулы – компактные скопления паразитов в вакуолях-фагосомах, имеющие вид тутовой ягоды или малины.¹⁷ Надо иметь ввиду, что нередко при этом способе окраски за тельца-включения ошибочно принимают цитоплазматические гранулы неинфицированных лейкоцитов.

Возбудитель может быть обнаружен в патологическом материале, начиная с 10-14 дня после заражения, с помощью прямого варианта РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Ее проводят с фракцией лейкоцитов или на мазках крови и внутренних органов подозреваемого в заражении E. canis животного. Тест характеризуется высокими чувствительностью и специфичностью. Особенно он ценен при хроническом течении инфекции.

Постмортально микроскопии подвергаются окрашенные мазки-отпечатки и тонкие срезы внутренних органов. Чаще всего возбудителя удается обнаружить в легких.

Обнаружение нуклеиновой кислоты возбудителя. ДНК возбудителя легче всего обнаружить с помощью ПЦР на всех стадиях болезни в селезёнке и крови. Чувствительность ПЦР при исследовании костного мозга значительно ниже. Обнаружить нуклеиновую кислоту возбудителя в организме больной собаки удается уже через 7 дней, что значительно опережает срок появления (14-21 день) специфических антител.

Выделение возбудителя. Выделить E. canis удается культивированием in vitro моноцитов подозреваемого в заражении животного либо заражением взятым от больного животного патологическим материалом (при жизни – кровью и аспирированной из лимфатических узлов жидкостью, постмортально - селезенкой) чувствительных к возбудителю культур клеток. Метод имеет особенно большое значение при обследовании собак на субклинической стадии болезни. Он превосходит по чувствительноси ПЦР и РИФ, однако его основным недостатком служат значительные затраты времени (14-34 дня) для получения результатов.

Биопробу как правило не ставят, поскольку лабораторные животные (мыши, крысы, морские свинки, хомячки) к E. canis нечувствительны.¹⁸ В ряде случаев возможна постановка биопробы на собаках путем гемотрансфузии.

Серологические исследования. Разработано несколько методов серологической диагностики эрлихиоза собак – РНИФ и ELISA.

Раньше диагностическим считался титр сывороточных антител 1:40 и более. Однако в связи с широким распространением инфекции E. canis, возможностью заражения собак большим количеством других видов эрлихиозов, дающих перекрестные реакции, его значение повысили до 1:80-1:160. Гораздо более надежным диагностическим критерием служит не абсолютная величина титра сывороточных антител, выявленная у собаки при однократном исследовании, а сероконверсия.

Сероконверсия - это приобретение или повышение титра антител к антигену, который попадает в организм в результате инфекции или иммунизации. Понятие сероконверсия часто используется в диагностике и эпидемиологии как признак инфекции или критерий эффективности вакцинации. В обоих случаях для доказательства наличия сероконверсии требуется исследование парных (серийных) образцов сыворотки, первый из которых был взят до начала или в самом начале антигенного воздействия, а последующие — в период ожидаемого максимума иммунного ответа. Сероконверсия устанавливается путем одновременного титрования парных (серийных) образцов сыворотки в соответствующем серологическом тесте, причем достоверным признается увеличение титра, равное или превышающее два шага разведения, т. е., если при постановке теста сыворотки разводятся 1:2; 1:4; 1:8 и т. д., то сероконверсией можно считать 4-кратный и выше прирост титра; если же сыворотки разводятся 1:5; 1:20; 1:80 и т. д., то сероконверсией считается не менее чем 16-кратное увеличение титра.

Для установления сероконверсии при эрлихиозе исследуют парные пробы сыворотки крови, взятые от животного с интервалом в 7-14 дней. Отсутствие высокого титра антител или сероконверсии нельзя безоговорочно считать доказательством отсутствия инфекции E. canis, так как специфические антитела при ней достигают выявляемого серологическими тестами уровня не ранее 3 недель после заражения.

Особенно большую роль серологическая диагностика приобретает при нахождении животного на субклинической стадии заболевания, когда отсутствует симптоматика.

Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Данный тест первым стали применять при эрлихиозе собак и до настоящего времени он остается золотым стандартом обнаружения антител к E. canis. Сероконверсию собак к E. canisвыявляют в РНИФ приблизительно через 10 дней.

Основным недостатком этого теста является невозможность дифференцировать с его помощью E. canis от других близкородственных эрлихий и неориккетсий собак. Для решения этой задачи предложено проводить РНИФ с рекомбинантными протеинами E. canis с мМас 28, 43 и 140 кД. Мажорный наружный мембранный протеин возбудителя с мМас 28 кД оказался консервативным для всех его штаммов, циркулирующих на определенной территории, что делает антитела к нему одним из основных маркеров инфекции. Но он дает перекрестные реакции с E. chaffeensis, E. ewingii и N. helminthoeca, что отражается на специфичности серологических тестов. Протеин с мМас 43 кД реагирует только с гомологичными антисыворотками и не дает перекрестных реакций с другими видами эрлихий.

Важным недостатком РНИФ служит и то, что ее показания в течение длительного времени (до 3 лет) остаются положительными после завершения лечения животного и элиминации его из организма возбудителя.

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (иммуноферментный анализ).

Этот тест проявляет равные с РНИФ чувствительность и специфичность при выявлении IgG- и IgM-антител к E. canis, но отличается более высокой воспроизводимостью результатов. Для проведения теста фирма Helica Biosystems выпускает набор диагностикумов Immunocomb. специально для ветеринарных клиник разработан также упрощенный вариант дот-ELISA.

Обнаружение IgG-антител указывает на имевший место контакт животного с возбудителем, а IgM-антител дает основание подозревать инфекцию, которая развивается в момент проведения серологического анализа.

Для ELISA антиген готовят экстрагированием детергентами наружных мембранных протеинов E. canis либо обработкой инфицированных культур ультразвуком. Предложено также использовать рекомбинантный мажорный поверхностный антиген E. chaffeensis с мМас 26 кД для выявления в ELISA антител к E. canis.

Носительство. У выздоровевших собак развивается носительство возбудителя продолжительностью до 3 лет. Бессимптомное носительство часто сопровождается столь низким титром возбудителя в тканях, что его не удается выявить в ПЦР, заражением культур клеток или биопробой на собаках, проводимой влиянием крови исследуемых животных.¹⁹