3.3.3. Связывание избыточного аммиака

При интенсивном дезаминировании аминокислот и других азотистых

веществ в организмах в ходе диссимиляции органических соединений высвобождается большое количество аммонийной формы азота, которая в высоких концентрациях токсична для растительных тканей. Повышение концентрации аммонийного азота в растениях наблюдается также при внесении аммонийных форм азотных удобрений. Поступающий в растение из почвы или образовавшийся в результате распада азотистых веществ аммонийный азот активно используется для синтеза аминокислот, вступая в реакции восстановительного аминирования с кетоаналогами аминокислот. Однако, если концентрация аммонийного азота в растительных тканях чрезмерно повышается, в действие вступают механизмы связывания аммиака, защищающие растения от аммиачного отравления.

Как установлено в опытах, признаки аммиачного отравления у растений с нейтральным клеточным соком наблюдаются при содержании в вегетативной массе свыше 30–40 мг% аммонийного азота. Более устойчивы к аммиачному отравлению растения с кислым клеточным соком (рН 1,3–4) – щавель, бегония, ревень, пеларгония, осоки, хвощи и др. У этих растений в клеточном соке накапливается много органических кислот (яблочной, щавелевой, лимонной, янтарной и др.), которые связывают аммиачный азот в виде аммонийных солей и таким образом предотвращают аммиачное отравление указанных растений.

СН₂–СООН CH₂COONH₄

| + NH₃ ¾® |

CHOH–COOH CHOH–COOH

яблочная кислота малат аммония

У большинства культурных растений реакция клеточного сока близка к нейтральной, поэтому они не способны связывать в виде солей большое количество аммонийного азота, образующегося при распаде азотистых веществ или поступающего в растения из почвы. У них избыточный аммонийный азот обезвреживается путём образования амидов дикарбоновых аминокислот – глутамина и аспарагина. На синтез амидов затрачивается метоболическая энергия, которая высвобождается за счёт гидролиза АТФ. Реакция синтеза глутамина из глутаминовой кислоты и аммиака с участием АТФ под действием фермента глутаминсинтетазы была показана ранее (стр. 169). Образование аспарагина катализирует фермент аспарагинсинтетаза (6.3.5.4), способный за счёт гидролиза глутамина осуществлять синтез амидной группировки аспарагина в результате следующей реакции:

СН₂–СООН CH₂CONH₂ CH₂CONH₂ СН₂–СООН

| + | | + |

CHNH₂–COOH CH₂ + АТФ ® CHNH₂–COOH CH₂

| ↓ |

аспарагиновая CHNH₂–COOH АМФ аспарагин CHNH₂–COOH

кислота глутамин Н₄Р₂О₇ глутаминовая

кислота

Кроме аспарагина и глутаминовой кислоты продуктами данного превращения также являются аденозинмонофосфат и дифосфорная кислота, возникающие в результате гидролиза макроэргической связи АТФ между первым и вторым остатками ортофосфорной кислоты.

Изучение процесса ассимиляции аммонийной формы азота, поступающей в растения из почвы, показывает, что почти весь аммиачный азот превращается в корнях в аммонийный азот аминокислот и амидный азот глутамина и аспарагина. Поэтому более половины азота, переносимого из корней в вегетативную часть растений с ксилемным и флоэмным соком, представлено амидами. Аспарагин и глутамин, образующиеся при связывании избыточного аммиака, активно участвуют в различных биохимических процессах как доноры аминных групп и источники образования других азотистых веществ.

О

//

НООС–СН–СН₂–С–С–NH₂

| ||

NH₂ CH₂

У некоторых растений (арахис, тюльпаны, бобы, горох, хмель) основным веществом, в виде которого связывается избыточный аммиачный азот, является производное глутамина – g-метиленглутамин:

Синтез мочевины. В клетках растений существует ещё один дополнительный механизм обезвреживания избыточной аммонийной формы азо-та – связывание его в виде мочевины, которая синтезируется в реакциях орнитинового цикла, впервые изученного в 1932 г. в клетках животных Н.А. Кребсом и К. Хензелайтом.

Опытным путем было установлено, что концентрация мочевины в клетках растений увеличивается при диссимиляции азотистых веществ, когда активируются процессы дезаминирования аминокислот и азотистых оснований, а также при выращивании растений на растворах аммонийных солей. Мочевина нетоксична для клеток растений, так как является нормальным продуктом обмена веществ.

O О СООН

// Mg²⁺ \\ |

HCO₃^－¯ + C–NH₂ + 2АТФ ¾¾® С–О~Ⓟ + 2АДФ + Н₃РО₄ + CH₂

| + Н₂О / |

CH₂ Н₂N CH₂

| |

CH₂ карбамоил- CHNH₂

| фосфат | CHNH₂–СООН COOH

глутамин глутаминовая

кислота

Первый этап синтеза мочевины – образование макроэргического соединения карбамоилфосфата из гидрокарбоната и глутамина, служащего источником аминной группировки, под действием фермента карбамоилфосфатсинтазы (2.7.2.5). Реакция сопряжена с гидролизом двух молекул АТФ и активируется катионами Mg²⁺:

На следующем этапе с участием фермента орнитинтранскарба-моилазы (2.1.3.3) карбамоилфосфат вступает во взаимодействие с орнитином. Продукты этой реакции – цитруллин и неорганический фосфат:

CH₂NH₂ О CH₂NH

| \\ | \

CH₂ С–NH₂ CH₂ C= O

| + | ¾® | | + H₃PO₄

CH₂ O~Ⓟ CH₂ NH₂

| |

CHNH₂ карбамоил- CHNH₂

| фосфат |

COOH COOH

орнитин цитруллин

Таким образом, уреидогруппа цитруллина образуется из карбонильной группы бикарбоната и амидной группы глутамина, которая синтезируется в результате связывания избыточного аммиака.

Далее цитруллин реагирует с аспарагиновой кислотой под действием фермента аргининосукцинатсинтетазы (6.3.4.5). В активировании уреидогруппы цитруллина принимают участие АТФ и катионы Mg²⁺. В ходе этой реакции синтезируется аргининоянтарная кислота. Затем аргининоянтарная кислота с участием фермента аргининосукцинатлиазы (4.3.2.1) расщепляется на два продукта – аргинин и фумаровую кислоту.

CH₂NH CH₂NH COOH СH₂NH CООН

| \ | \ | | \ |

CH₂ С=О COOH CH₂ C=N–CH CH₂ C=NH CH

| | | Mg²⁺ | | | | | ||

CH₂ NH₂ + CHNH₂ + АТФ ¾® CH₂ NH₂ CH ¾® CH₂ NH₂ + CH

| | ↓ | | | |

CHNH₂ CH₂ АМФ CHNH₂ COOH CHNH₂ НООC

| | Н₄Р₂О₇ | | фумаровая

COOH COOH COOH COOH кислота

цитруллин аспарагиновая аргининоянтарная аргинин

кислота кислота

СН₂NH CH₂NH₂

| \ |

CH₂ C=NH CH₂ | | + H₂O ¾® | + CO(NH₂)₂

CH₂ NH₂ CH₂ | | мочевина

CHNH₂ CHNH₂

| |

COOH COOH

аргинин орнитин

Аргинин в орнитиновом цикле путём гидролитического расщепления превращается в орнитин и мочевину. Эту реакцию катализирует фермент аргиназа (3.5.3.1):

Высвобождающийся при гидролизе аргинина орнитин снова включается в первую реакцию орнитинового цикла, и синтез мочевины может продолжаться. У некоторых растений связывание избыточного аммиака не доходит до образования мочевины, у них наблюдается накопление промежуточных продуктов орнитинового цикла – цитруллина или аргинина.

Конечный продукт связывания аммиака в реакциях орнитинового цикла – мочевина – очень легко включается в обмен азотистых веществ растений с участием соответствующих ферментных систем. В листьях и других органах многих растений находится в активном состоянии или может активироваться мочевиной фермент уреаза, катализирующий гидролитическое разложение мочевины на диоксид углерода и аммиак:

Н₂N

\ уреаза

C=O + H₂O ¾® 2NH₃ + CO₂

/

H₂N

мочевина

Затем аммиак включается в синтез аминокислот и амидов, которые далее могут участвовать в образовании молекул других азотистых веществ. Фермент уреаза обнаружен у многих растений – огурцов, бобов, кукурузы, картофеля, томатов, сельдерея. Однако у ряда растений уреаза отсутствует, однако они способны ассимилировать мочевину, наносимую на поверхность листьев или вводимую в ткани растений экзогенно, с помощью другого фермента – АТФ-гидролизующей уреазы (3.5.1.45), способной в присутствии АТФ и катионов Mg²⁺ разлагать мочевину на аммиак и диоксид углерода:

Mg²⁺

Н₂N–С–NH₂ + АТФ + 2Н₂О ¾¾® 2NH₃ + CO₂ + AДФ + H₃PO₄

||

O

Вместе с тем при изучении ассимиляции мочевины листьями растений, не имеющих уреазы, было отмечено накопление в них значительного количества аргинина и аргининоянтарной кислоты. На основе этих данных была сформулирована гипотеза об обращении реакций орнитинового цикла при высокой концентрации в клетках растений мочевины, поступающей извне в виде некорневой подкормки или при выращивании на среде, содержащей мочевину. Синтез аргинина и аргининоянтарной кислоты в соответствии с этой гипотезой может осуществляться по следующей схеме:

CH₂NH₂ CH₂NH фумаровая CH₂NH COOH

| H₂N | \ кислота | \ |

CH₂ \ CH₂ C= NН ↓ CH₂ C= N–CH

| + C=O ¾® | │ ‌ ¾¾® | | |

CH₂ / ↓ CH₂ NH₂ CH₂ NH₂ CH₂

| H₂N H₂O | | |

CHNH₂ мочевина CHNH₂ CHNH₂ COOH

| | |

COOH COOH COOH

орнитин аргинин аргининоянтарная

кислота

В результате расщепления аргининоянтарной кислоты могут далее образоваться цитруллин и аспарагиновая кислота. При этом цитруллин, превращаясь в орнитин, инициирует продолжение обращения реакций орнитинового цикла, направленное на связывание мочевины и образование аргинина, а аспарагиновая кислота является основным продуктом этих реакций, который далее включается в синтез аминокислот, белков и других азотистых веществ. На усвоение мочевины в результате обращения реакций орнитинового цикла затрачивается метаболическая энергия, которая генерируется через усиление дыхания, наблюдаемое при таких процессах.

Понимание механизмов усвоения растениями мочевины имеет важное значение в связи с её широким использованием в качестве азотного удобрения при некорневых подкормках, которые чаще всего проводятся при возделывании пшеницы и кукурузы. Растения опрыскивают раствором мочевины с помощью самолётов или при наличии технологической колеи наземными агрегатами в фазах формирования – начала молочной спелости зерна. Нанесённая на листья мочевина быстро проникает в их ткани и включается в синтез аминокислот и белков, увеличивая таким образом накопление в зерне запасных белков на 1–3%. В наших опытах с использованием мочевины, меченной ¹⁵N, показано, что азот некорневой подкормки, проведенной в фазу начала формирования зерна, в зрелых зерновках пшеницы может составлять до 14% белкового азота зерна.