3.3.4. Синтез аминокислот с использованием нитратной формы азота

Большая часть азота, поступающего в растения при корневом питании, представлена нитратами, которые очень легко усваиваются растениями, включаясь в синтез аминокислот. Однако нитратный азот в растениях, прежде чем включиться в состав аминокислот, подвергается восстановлению в аммонийную форму с помощью специальных ферментных систем.

Восстановление нитратного азота в аммонийный в клетках растений осуществляется в два этапа. На первом этапе под действием фермента нитратредуктазы происходит превращение нитратов в нитриты, а затем нитриты с участием фермента нитритредуктазы восстанавливаются с образованием аммонийной формы азота, которая используется для синтеза аминокислот и амидов. Схематически эти процессы можно представить следующим образом:

+5 2ē +3 6ē –3

NO₃‾ ¾® NO₂‾ ¾® NH₄⁺

Нитратредуктазы (1.6.6.1; 1.6.6.2; 1.6.6.3) представляют собой металлофлавопротеиды с молекулярными массами 200–330 тыс., локализованные в цитоплазме растительных клеток. В составе фермента содержатся флавиновые группировки (ФАД, ФМН) и молибденовый кофермент. Донором электронов для восстановления нитратного азота у растений служит НАД × Н, у грибов – НАДФ × Н. От восстановленных динуклеотидов электроны и протоны переходят на флавиновую группировку нитратредуктазы. Затем электроны передаются на цитохром в₅₅₇, служащий в составе фермента промежуточным переносчиком электронов от флавинового кофермента на молибденовый, а протоны высвобождаются и могут взаимодействовать с анионами кислорода, которые образуются при восстановлении нитратного азота.

Молибденовый кофермент содержит катионы молибдена, лабильно связанные с ароматической группировкой, которая нековалентно присоединяется к белковой части фермента. Катионы молибдена, обратимо изменяя степень окисления, способны акцептировать электроны от цитохрома в₅₅₇ и передавать их на азот нитрата, который связывается с активным центром фермента. В результате восстановления азота нитрат превращается в нитрит, а высвобождающийся анион кислорода О²‾ соединяется с протонами, образуя молекулу воды. Механизм восстановления нитратов до нитритов под действием нитратредуктазы может быть представлен в виде следующей схемы:

Суммарно процесс восстановления нитратов до нитритов в растениях под действием фермента нитратредуктазы может быть выражен следующим уравнением:

NO₃‾ + НАД × Н + Н⁺ ¾® NO₂‾ + НАД⁺ + Н₂О

При активном фотосинтезе и достаточном количестве углеводов, являющихся источниками образования НАД × Н, процесс восстановления нитратов практически полностью происходит в корнях. Однако при недостатке света и низких температурах, ослабляющих синтез углеводов, а также избыточном азотном питании значительная часть нитратов поступает в вегетативную часть растений и подвергается восстановлению в листьях. Вместе с тем известны растения, у которых превращение нитратного азота в аммонийный осуществляется в основном в листьях (свёкла, хлопчатник, марь, дурнишник и др.).

Нитратредуктаза – типичный индуцибельный фермент. Его активность резко возрастает при поступлении в растения нитратов вследствие того, что происходит индукция синтеза фермента. Когда же концентрация нитратов в клетках растений уменьшается, синтез ферментного белка прекращается и нитратредуктазная активность снова понижается до исходного уровня. Кроме нитратов индукторами синтеза нитратредуктазы могут быть цитокинин и органические нитросоединения, т.е. возможна индукция синтеза этого фермента под воздействием химических регуляторов. В то же время катионы аммония подавляют в растениях синтез нитратредуктазы.

Восстановление нитритов в аммонийную форму азота катализируют ферменты нитритредуктазы (1.6.6.4.; 1.7.99.3). У растений и фотосинтезирующих водорослей эти ферменты представляют собой сравнительно низкомолекулярные белки (60–70 тыс.), которые содержат в качестве активных группировок железосерный центр ( 4Fe4S) и сирогем (железотетрагидропорфирин). Донором электронов служит восстановленный ферредоксин, поэтому нитритредуктазы у указанных организмов локализованы в хлоропластах.

Ферредоксин передаёт электроны на железосерный центр нитритредуктазы, который далее восстанавливает сирогем, способный передавать электроны на атомы азота нитритов, в результате происходит присоединение к ним протонов и образование аммонийной формы азота. Высвобождающиеся анионы кислорода О^2-, реагируя с катионами Н⁺, дают молекулы воды. Перенос электронов от восстановленного ферредоксина на нитриты с участием нитритредуктаз можно показать в виде следующей схемы:

Фд_восст. ¾® 4Fe4S ¾® сирогем ¾® NO₂‾

Суммарное уравнение процесса восстановления нитритов под действием нитритредуктазы можно записать в следующем виде:

NO₂‾ + 6Фд_восст. + 8Н⁺ ¾® NH₄⁺ + 6Фд_окисл. + 2Н₂О

Каталитическая активность нитритредуктаз в 5–20 раз превышает ак-

тивность нитратредуктазы, поэтому нитриты, как правило, не накапливаются в растениях. В корнях нитритредуктазная активность локализована в пропластидах, и донорами электронов для восстановления нитритов здесь служат восстановленные динуклеотиды НАДФ × Н. Нитритредуктазы, как и нитратредуктазы, – индуцибельные ферменты. Индукцию их синтеза вызывают нитраты, а репрессию – катионы аммония.

Существующие разновидности растений очень сильно различаются по способности восстанавливать нитраты, которая зависит главным образом от уровня нитратредуктазной активности, тогда как нитритредуктазы – каталитически более активные ферменты. Общий уровень нитратредуктазной активности определяется, с одной стороны, интенсивностью синтеза ферментного белка, а с другой – каталитической способностью фермента.

Важная задача при выращивании продовольственных и кормовых сельскохозяйственных культур – понизить накопление в растительной про-дукции нитратов, так как они потенциально опасны для человека и животных. Нитраты очень легко восстанавливаются в нитриты неферментативным путём, а последние, взаимодействуя с гемоглобином, переводят его в метгемоглобин, не способный осуществлять функцию транспорта кислорода, в результате ухудшается обеспеченность им организма. Кроме того, нитриты являются химическими предшественниками нитрозоаминов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием.

Известны группы растений с невысоким уровнем нитратредуктазной активности, вследствие чего они характеризуются высоким содержанием нитратов. К таким видам относятся растения семейства тыквенных, шпинат, редька и др. Однако у большинства растений повышение содержания нитратов наблюдается при неблагоприятных условиях выращивания, связанных с недостатком световой энергии; низкой температурой; недостатком фосфора, калия, ряда микроэлементов, избыточными дозами азотных удобрений. Поэтому для каждой группы растительных продуктов установлена предельно допустимая концентрация нитратов.

При недостатке света ослабляются процессы фотосинтеза и дыхания, в результате чего понижается скорость образования восстановленных динуклеотидов и восстановленного ферредоксина, служащих донорами электронов для восстановления нитратов, поэтому значительная их часть остаётся невосстановленной и не используется для синтеза азотистых веществ растений. Аналогичное явление наблюдается в условиях пониженных температур, когда замедляются биохимические процессы, связанные с регенерацией доноров электронов для нитратвосстанавливающей системы, тогда как поступление нитратов в растения продолжается, вследствие чего их концентрация в растительных тканях возрастает.

Заметное влияние на функционирование нитратвосстанавливающей системы растений оказывает обеспеченность их микроэлементами – молибденом, железом, магнием, марганцем, медью, которые служат активаторами нитратредуктазы, нитритредуктазы и других ферментов азотного обмена. Особенно важна роль молибдена, входящего в состав молибденового кофермента нитратредуктазы. При недостатке молибдена и других микроэлементов замедляется процесс восстановления нитратов и происходит их накопление в растительных продуктах. Ещё большее накопление нитратов в растениях наблюдается при внесении избыточных доз азотных удобрений, а также при низкой обеспеченности растений фосфором и калием, когда формируется низкий урожай. В этих условиях даже умеренные дозы азотных удобрений могут оказаться избыточными.

Таким образом, для предотвращения накопления в растениях большого количества нитратов необходимо правильно разрабатывать технологию выращивания растений, обеспечивая оптимальное питание растений макро- и микроэлементами. Особенно важно контролировать уровень азот-ного питания при выращивании овощных и кормовых культур.