Парентеральные стимуляторы

В качестве парентеральных (вводимых с помощью инъекций) стимуляторов наиболее распространены гистамин, пентагастрин и инсулин.

Наибольшее распространение в качестве стимулятора получил гистамин — естественный стимулятор главных клеток слизистой оболочки желудка.

Субмаксимальная проба по Ламблену (фр. Lambling A. P. N.) (1952). Вводится солянокислый или фосфорнокислый гистамин из расчёта 0,1 мг на 10 кг веса пациента и в течение двух часов каждые 15 минут полностью откачивается желудочный сок.

Максимальная гистаминовая проба по Кау (1953). В течение 45 минут исследуют базальную секрецию, затем вводят антигистаминовый препарат и в течение получаса собирают желудочный сок. Затем парентерально вводится гистамин из расчёта 0,4 мг на 10 кг веса пациента (по данным Кау такая доза обеспечивает максимальную стимуляцию париетальных клеток слизистой желудка) и затем ещё 45 минут откачивают желудочный сок.

Наиболее физиологичным и безопасным парентеральным стимулятором является пентагастрин — синтетический аналог гастрина. Применяется в виде 0,025 % раствора. Вводится подкожно из расчета 0,006 мг на 1 кг веса пациента. После введения пентагастрина секреция усиливается через 5 — 10 минут, достигает максимума через 15 — 30 минут и продолжается в течение часа и более. Исследование желудочного сока проводят обычно через каждые 15 минут в течение часа и более.

Инсулин является мощным стимулятором главных и, в меньшей степени, париетальных клеток слизистой желудка. Он вводится внутривенно из расчёта 2 ед. на 10 кг веса пациента. Действует инсулин быстро и длительно (до 2 часов). Однако использование его в клинической практике затруднено из-за выраженного сахароснижающего эффекта. Данный способ стимуляции используют главным образом в хирургической практике для контроля полноты ваготомии и в последнее время применяется редко из-за того, что одинаковые дозы инсулина могут вызвать гипогликемию различной степени и невозможности обосновать наиболее эффективную дозу инсулина.

Противопоказания к использованию парентеральных стимуляторов

Противопоказания к использованию гистамина и инсулина:

тяжёлые формы сердечной и легочной недостаточности;

тяжёлые формы гипертонической болезни;

почечная недостаточность;

печеночная недостаточность;

тяжёлые формы сахарного диабета;

тяжёлые формы аллергических реакций в анамнезе.

Противопоказания к использованию пентагастрина:

недостаточность кровообращения II–III стадии;

нарушения сердечного ритма;

выраженная гипотензия.

Внутрижелу́дочная рН-метри́я — медицинская диагностическая процедура, в процессе которой производят измерение кислотности непосредственно в желудочно-кишечном тракте. Обычно к внутрижелудочной рН-метрии относят измерение кислотности в пищеводе, желудке и двенадцатиперстной кишке.

Клиническое значение рН-метрии

Клиническое значение рН-метрии верхних отделов пищеварительного тракта заключается в наилучшей диагностике функциональных нарушений при кислотозависимых заболеваниях ЖКТ, позволяющей во всех случаях, особенно при сочетанных патологиях, выработать адекватную тактику лечения и контролировать ход лечения. рН-метрия особенно важна в случаях, когда стандартные схемы лечения гастроэнтерологических, а также потенциально связанных с ними кардиальных, бронхолегочных, лорфарингеальных, стоматологических и др. патологий не дают положительного результата.

Виды внутрижелудочной рН-метрии

суточная рН-метрия пищевода (в течение 24 часов и более);

суточная рН-метрия желудка (в течение 24 часов и более);

кратковременная внутрижелудочная рН-метрия (в течение 2-3 часов);

экспресс рН-метрия (в течение 15-20 минут);

эндоскопическая рН-метрия (во время гастроскопии).

Кратковременная внутрижелудочная рН-метрия

Кратковременная внутрижелудочная рН-метрия используется для исследования кислотообразующей и кислотонейтрализующей функций желудка в базальных условиях и после стимуляции (гистамином или пентагастрином). Измеряются средние уровни рН в разных отделах желудка, и по ним делается заключение.

Основным функциональным тестом при кратковременной внутрижелудочной рН-метрии является щелочной тест Ноллера. Он заключается в том, что пациенту через рот вводят в желудок 0,5 г бикарбоната натрия (пищевой соды), растворенного в 30 мл воды, и с помощью прибора для внутрижелудочной рН-метрии регистрируют динамику рН в теле желудка. В результате введения щёлочи происходит реакция нейтрализации соляной кислоты HCl + NaHCO3=NaCl + CO2 + H2O, уровень рН повышается, а через, так называемое, щёлочное время возвращается к исходному уровню из-за выделения соляной кислоты в желудке.

Показания для проведения внутрижелудочной рН-метрии

гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ);

язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки;

различные формы хронического гастрита, дуоденита, диспепсии;

Синдром Золлингера — Эллисона;

пищевод Барретта;

оценка действия лекарственных средств, снижающих секрецию, их индивидуальный подбор для больного;

состояния после резекции желудка.

Противопоказания для проведения внутрижелудочной рН-метрии

Противопоказания к исследованию складываются из противопоказаний к введению желудочного зонда и противопоказаний к использованию тех или иных стимуляторов или ингибиторов желудочной секреции.

Для более объективной оценки кислотообразующей функции желудка вычисляют абсолютную кислотную продукцию за единицу времени, обычно за 1 ч (дебит-час). В зависимости от используемого при расчете показателя кислотности различают дебит-час свободной соляной кислоты и дебит-час соляной кислоты (общая кислотная продукция за час).

Дебит-час (Д-Ч) выражают в миллимолях (или в мг) и вычисляют:

Д-Ч = Y1 * E1 * 0,001 + Y2 * E2 * 0,001 + Y3 * E3 * 0,001… + ...Yn * En * 0,001,

где Y — объем порции желудочного сока, мл;

Е — концентрация свободной соляной кислоты или общая кислотность, титр. ед. (моль/л);

0,001 — количество миллимолей соляной кислоты в 1 мл желудочного содержимого при ее концентрации, равной одной титрационной единице. Для выражения дебита (Д) в мг каждое из слагаемых умножают на 36,5 — молекулярную массу соляной кислоты. Число слагаемых в формуле равно числу порций желудочного содержимого, полученного за время исследования (при расчете Д-Ч их обычно 4).

Поскольку величина дебита-часа зависит от часового напряжения секреции и величины кислотности, следует добиваться полного извлечения желудочного содержимого.

Общую кислотную продукцию в период базальной секреции обозначают ВАО (basal acid output), при максимальной — МАО (maximal acid output), при субмаксимальной стимуляции гистамином — SAO. Показатели МАО находятся в зависимости от массы обкладочных клеток.

Методы диагностики Helicobacter pylori (НР)

ВВЕДЕНИЕ

Важной особенностью Helicobacter pylori является тропность к поверхностному эпителию слизистой оболочки желудка: адгезия этих микроорганизмов в слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки возможна только в тех случаях, когда происходит метаплазия желудочного эпителия в двенадцатиперстную кишку. Оптимальной для внедрения и активации Helicobacter pylori в слизистой оболочке является рН от 4 до 8. Более кислое желудочное содержание (рН < 3,5) приводит к инактивации микроорганизма. Поэтому излюбленной локализацией Helicobacter pylori является антральный отдел желудка, где обычно происходит полная или частичная нейтрализация свободной НСl слизистым секретом. НР располагается в слизистой оболочке под слоем слизи. Отчетливо выраженная уреазная активность микроорганизма позволяет разлагать мочевину, окружая себя аммиаком, защищающим его от воздействия НСl. В биопсийном материале Helicobacter pylori имеют спиралевидную, изогнутую, S-образную форму. Это интенсивно окрашенные бактерии с жгутиками на одном конце. Helicobacter pylori вырабатывает целый ряд веществ, обладающих прямым цитотоксическим эффектом на слизистую оболочку желудка, вызывая ее воспаление, а в дальнейшем, при распространении патологического процесса на более глубокие слои слизистой оболочки, - атрофию железистого аппарата. При длительном инфицировании Helicobacter pylori патологический процесс из антрального отдела распространяется на тело желудка, что сопровождается выраженными явлениями атрофии слизистой оболочки (пангастрит). У больных, инфицированных Helicobacter pylori, нередко развивается хронический активный гастродуоденит, чаще пилородуоденит. Дуоденит развивается под воздействием Helicobacter pylori на фоне хеликобактерного гастрита и метаплазии желудочного эпителия в двенадцатиперстную кишку. Причиной такой метаплазии слизистой двенадцатиперстной кишки считают заброс избыточно кислого желудочного содержимого в двенадцатиперстную кишку в связи с гиперсекрецией НСl. Обсеменение Helicobacter pylori происходит именно в участках желудочной метаплазии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. На фоне активного гастрита и хронического активного дуоденита, ассоциированных с НР, наблюдается значительное снижение резистентности слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки к воздействию различных агрессивных факторов, в первую очередь, кислотно-пептического. В результате развиваются язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ Helicobacter pylori

Наиболее распространенными из них являются цитологический, уреазный и гистологический методы.

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ метод исследования

Материалом для цитологического исследования служат мазки-отпечатки биоптатов, полученные при эндоскопии из участков слизистой оболочки антрального отдела желудка или двенадцатиперстной кишки с наиболее выраженными морфологическими изменениями (гиперемия, отек и т.п.). Мазки высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму или метанолазурэозиновой смесью. Микроскопия окрашенных мазков-отпечатков позволяет выявить наличие Helicobacter pylori и ориентировочно оценить количество микроорганизмов.

Выделяют три степени обсемененности слизистой оболочки:

I.слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения

II.средняя (++) - от 20 до 40 микробных тел в поле зрения

III.высокая (+++) - более 40 микробных тел в поле зрения

УРЕАЗНЫЙ ДЫХАТЕЛЬНЫЙ тест

В развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал уреазный дыхательный тест, который основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3 ¯ и NH4 +. Из НСО3¯ образуется СО2, который, попадая в кровоток, затем транспортируется в легкие. Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом ¹³С или 14С. Чаще в клинической практике применяется нерадиоакивный стабильный углерод ¹³С. 14С используется реже, так как является источником излучения низкоэнергетических β-частиц, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком. Изотоп количественно определяют газовым хроматомасс-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат; в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение ¹³СО2 – δ¹³СО 2, его экскреция (‰) и считается положительной при значениях выше 5‰.

В ряде стран используется определение изотопного отношения концентраций ¹³СО2/¹²СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

При использовании дыхательного уреазного теста ложноположительные результаты считаются редкими (4-10%), ложноотрицаельные результаты возможны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадикации уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов.

Метод быстрый, удобный, но ограничен в распространении из-за необходимости использовать дорогостоящее оборудование и изотопные препараты. Поскольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стоимость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило свести к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными лекарственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченной мочевины существенно повышает конкурентноспособность этой методики, т.к. стоимость и самого изотопа, и оборудования для его проведения в среднем меньше в 10 раз, чем масс-спектрометра.

БЫСТРЫЙ УРЕАЗНЫЙ тест

Уреазный тест («кампи-тест») относится к числу экспресс-методов выявления Helicobacter pylori.

Стандартный «кампи-тест» состоит из:

•содержащего мочевину геля-носителя

•раствора азида натрия

•раствора фенол-рота - используется в качестве индикатора рН, который при сдвиге рН среды в щелочную сторону меняет свой цвет от желтого к малиновому; сдвиг рН происходит в том случае, если под действием хеликобактерной уреазы происходит гидролиз мочевины с образованием аммиака

В качестве источника хеликобактерной уреазы используют биоптаты слизистой оболочки, которые помещают в луночку специальной плашки из синтетического материала, заполненную готовой стерильной средой.

Появление малинового окрашивания теста свидетельствует о наличии в биоптате микробных тел Helicobacter pylori.

О количестве Helicobacter pylori в биоптате косвенно судят по времени изменения окраски теста:

•значительное инфицирование слизистой оболочки НР (+++) - малиновая окраска теста появляется в течение 1 часа от начала исследования

•умеренное инфицирование слизистой оболочки НР (++) - окраска индикатора изменяется через 2–3 часа

•незначительное инфицирование слизистой оболочки НР (+) - малиновое окрашивание теста появляется к концу суток

Более позднее окрашивание теста относят к отрицательным результатам.

При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован Helicobacter heilmanii, имеющим близкое сродство с Helicobacter pylori

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ методы ("золотой стандарт" диагностики)

Данные методы методы исследования биоптатов, наряду с возможностью детального изучения морфологических изменений в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки, позволяют выявить Helicobacter pylori при обычной окраске по Романовскому–Гимзе. При эндоскопии биоптаты берут прицельно из антрального отдела желудка в 2–3 см от привратника и из участка с наиболее выраженными воспалительными изменениями слизистой.

Различные новые модификации этого метода, в частности, иммуноцитохимический метод с применением моноклональных антител или метод гибридизации ДНК, дают возможность не только существенно повысить чувствительность и специфичность гистологического выявления Helicobacter pylori, но и идентифицировать различные штаммы Helicobacter pylori, что важно для выяснения природы повторного инфицирования слизистой оболочки после эффективного антихеликобактерного лечения.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ микроскопия

Helicobacter pylori может быть обнаружен до микробиологического или гистологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Helicobacter pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

•нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани

•исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях

•результат может быть получен через 1-2 мин.

Процедура выполнения исследования:

•поместить биоптат на предметное стекло

•измельчить биоптат на стекле и добавить каплю физиологического расвора

•поместить на измельченный биоптат покровное стекло

•оместить приготовленный препарат в фазово-контрастный микроскоп

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с спользованием иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ методы

Иммунологические методы основаны на выявлении у больных, инфицированных Helicobacter pylori, специфических антител, которые можно обнаружить в сыворотке крови уже через 3–4 недели после инфицирования. Достаточно высокий титр антител сохраняется даже в периоде клинической ремиссии заболевания. Отрицательным тест становится после успешного антибактериального лечения, что позволяет использовать метод для контроля эффективности такой терапии. Для выявления специфических антител используют различные методики, в частности, метод иммуноферментного анализа (ИФА) с определением антител IgG и IgA классов в сыворотке крови.

При оценке результатов иммунологического анализа следует помнить, что антитела к различным антигенам бактерии могут присутствовать в крови на протяжении года после эрадикации бактерий, что не позволяет применять методы для контроля результатов антигеликобактерного лечения.

Иммуногистохимический метод

Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Helicobacter pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Helicobacter pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления морфологически измененных (кокковых форм) Helicobacter pylori.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ метод

Наибольшую информацию о Helicobacter pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Helicobacter pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя.

Бактериологический метод исследования дает возможность определять антибиотикорезистентность у Helicobacter pylori и проводить за ней динамические наблюдения. Без бактериологического метода планировать клиническое испытание лекарственных препаратов, учитывая причины неудачи эрадикации, нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации – антибиотикорезистентность Helicobacter pylori.

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Helicobacter pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом.

В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Helicobacter pylori, изготовлять препараты для серологической диагностики, создать банк штаммовдля эпидемиологических и других исследований, так как штаммы бактерии в замороженном виде при температуре -70°С могут храниться в течение 5-7 лет. Без этого метода невозможно дальнейшее научное изучение микроорганизма. Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-14дней. В клинической практике он применяется в основном вслучаях инфекции Helicobacter pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии.

Helicobacter pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. Большой шаг вперед в успешном культивировании Helicobacter pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить сроктранспортировки биоптата из эндоскопического кабинета вмикробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, Кэри-Блэйера, Био Мерьо).

Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Helicobacter pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Helicobacter pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С... +39°С, но не растут при +27°С ...+42°С. Время инкубации: первичное исследование – 7 дней, контроль лечения - 14 дней.

На неселективной питательной среде Helicobacter pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Helicobacter pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. При появлении колоний, сходных по морфологии с Helicobacter pylori (диаметром до 0,5 – 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения слизистой оболочки желудка в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).

Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае Helicobacter pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование – уреазная, каталазная, оксидазная активность, Helicobacter pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК Helicobacter pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна.). Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм Helicobacter pylori. Выявлено, что вирулентность Helicobacter pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции. Существует ряд генов, продукты которых – белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A – полагают факторами патогенности. В зависимости от их наличия выделяютдва типа штаммов Helicobacter pylori. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.

ПЦР (относится к молекулярно-биологическим методам) представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.

Метод ПЦР в средах позволяет идентифицировать Helicobacter pylori без выделения чистой культуры по присутствующим в исследуемом материале фрагментам его генома.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.