1.6 Влияние ультрафиолетового облучения

на энтомопатогенные грибы

При искусственном солнечном освещении жизнеспособность спор Meta­rhizium anisopliae, Metarhizium flavoviridae и Beauveria bassiana заметно снижалась. Более интенсивно шел процесс заражения грибом Beauveria bassiana, если садки с зараженными насекомыми защищали от солнечных лучей. При интенсивности прямого солнечного света (0,8-0,9) кал/см²×мин уже через 60 минут жизнеспособность спор у Beauveria bassiana снижалась до 18,6%, у Beauveria brongniartii до 22,3%. Через 3 часа происходит полная инактивация спор. Установлено, что внесенные в биоценоз мускардиновые грибы погибают в кронах деревьев, но длительное время сохраняют активность в трупах насекомых и подстилке, то есть в местах, защищенных от солнечного света и других неблагоприятных факторов. При изучении влияния солнечного света на выживаемость конидий энтомопатогенного гифомицета Nomuraea rileyi также установлено резкое снижение жизнеспособности и патогенности конидий [1].

Изучали влияние экспозиции на реально встречающемся в среде фоне УФ-B-радиации (800 мВт/м²) на культивируемость и прорастание отдельных штаммов энтомопатогенов, прорастание спор Verticillium lecanii и Aphanocladium album. Повышенная экспозиция УФ-B снижала культивируемость всех штаммов; 4 ч. было достаточно для снижения ее до 0; 50%-ный летальный срок (LT50) варьировал от (120±5) мин. для штамма V. lecanii до (86±14) мин. для A. album. Отмечено значительное запаздывание прорастания выживших конидий. Не было существенных различий относительной культивируемости между конидиями, экспозированными на видимом свету после УФ-B инкубируемыми после УФ-B в темноте. Т. е., фотореактивация играет ограниченную роль в восстановлении повреждений, вызванных УФ-B у этих 2 видов [9].

Результаты опытов по влиянию ультрафиолетового облучения на выживаемость конидий Metarhizium anisopliae показали, что при жестком модельном ультрафиолетовом облучении жизнеспособность конидий природных штаммов и их морфологических варов резко снижается. Так, через 1 мин. после УФ-облучения осталось около 60% жизнеспособных конидий для штамма 85-69р и его морфоваров и около 80% жизнеспособных конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Через 3 мин в первом случае произошло снижение жизнеспособности конидий не менее чем в 5 раз, а во втором – не менее чем в 2,5 раза по сравнению с исходными значениями. Почти не осталось жизнеспособных спор через 5 и 7 мин соответственно для штаммов 85-69р и р-72. Это означает, что восприимчивость к УФ-облучению более высока для штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению с р-72 с соответствующими морфоварами. С другой стороны, выявились некоторые различия в устойчивости исходных штаммов и морфоваров с разной структурой колоний. Так, через 1 мин после УФ-облучения осталось 80% жизнеспособных конидий морфовара р-72-1 с пушистой структурой и лишь 63% морфовара р-72-2 с порошистой структурой.

В случае со штаммом 85-69р и его морфоварами эти различия несущественны. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что восприимчивость к ультрафиолетовому свету более высока для штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению со штаммом р-72 с соответствующими морфоварами. Это явление можно объяснить тем, что конидии штамма р-72 и его морфоваров насыщены темным меланиновым пигментом, что, как известно, является основной причиной высокой устойчивости пигментированных микроорганизмов к ультрафиолетовому излучению.

Для оценки антиоксидантов как протекторов от УФ-облучения в нативную суспензию спор гриба добавляли ионол и тирозол в количестве, необходимом для получения концентрации 0,15%. Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе ультрафиолетовым светом. О влиянии УФ-облучения на каждый штамм и о защитных свойствах добавленных антиоксидантов судили по выживаемости спор. При добавлении в суспензию антиоксиданта наблюдали полный или частичный защитный эффект от УФ-облучения. Так, для Metarhizium anisopliae 85-69р через 1 мин. облучения без антиоксиданта осталось 60% жизнеспособных спор, а при добавлении тирозола наблюдали практически полное сохранение жизнеспособности спор. Для р-72-1 с добавлением антиоксиданта через 7 мин. после УФО сохранялось в 10 раз больше спор, чем при облучении без добавления антиоксиданта.

Ультрафиолетовое облучение является наиболее сильным негативным фактором влияния на биоресурс гриба Metarhizium anisopliae, снижающим его жизнеспособность в модельном лабораторном эксперименте до нуля в течение 10 минут. Наиболее устойчивым к действию ультрафиолетового света среди изученных штаммов и их морфологических вариантов оказался морфовар р-72-1, что может быть связано с пигментацией его конидий. Антиоксиданты, использованные для сохранения жизнеспособности спор в процессе длительного хранения, могут также служить протекторами от ультрафиолетового излучения для повышения биоресурса гриба [10] .

Было изучено влияние длинноволнового УФ-излучения (280-400) нм на прорастание спор энтомопатогенного гриба Verticillium lecanii и его вирулентность. В качестве ультрафиолетовых протекторов были испытаны диоксид титана, диоксид кремния, аэросил и лигнин. Была обнаружена высокая чувствительность спор гриба Verticillium lecanii к ультрафиолетовому излучению. Под действием трехминутного облучения споры с добавками ультрафиолетовых протекторов полностью теряли способность к прорастанию. Только при добавлении диоксида титана прорастаемость составила 8%. При использовании этого ультрафиолетового протектора при облучении в течение 1 минуты уровень прорастания спор был почти в 2 раза выше (69%) по сравнению с другими ультрафиолетовыми протекторами ((32-42)%). В отсутствии облучения добавка ультрафиолетовых протекторов не оказывала ингибирующего действия на прорастание спор, за исключением аэросила, при котором наблюдали снижение прорастания спор на 10%.

Патогенные свойства гриба оценивали путем заражения личинок оранжерейной белокрылки суспензиями спор гриба (5,0×10⁶ спор/мл) с ультрафиолетовыми протекторами и без них с последующим облучением. Вирулентность необлученных спор достигала 70-79%. В результате облучения наблюдалось снижение вирулентности до 44% без применения ультрафиолетовых протекторов. В случае использования диоксида кремния и лигнина вирулентность оставалась высокой и составляла 76-80%, то есть на уровне необлученных спор. В этом случае диоксид титана не оказал необходимого защитного действия для сохранения патогенных свойств. При заражении виковой тли вирулентность препаративной формы, содержащей диоксид титана, после облучения была выше на 18%, чем без этого ультрафиолетового протектора.

Таким образом, проведенные исследования показали эффективность использования ультрафиолетовых протекторов при применении биоинсектицидов на основе гриба Verticillium lecanii для защиты от ультрафиолетового излучения и перспективность применения диоксида титана для защиты спор от солнечной радиации [11].

Трехчасовая экспозиция снижала жизнеспособность спор энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana на 4%, а вирулентность культуры в отношении личинок лиственничной мухи падала на 20%. Подобным образом падает жизнеспособность (на 4%) и вирулентность (на 14,4%) у гриба Beauveria tenella от действия прямых солнечных лучей [12].

Влияние различных доз ультрафиолетового света на вирулентность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana к европейскому кукурузному пилильщику, Ostrinia nubilalis Hbn., и радиальный рост гриба был изучен в лабораторных условиях. Суспензии штамма B. bassiana были подвержены ультрафиолетовому облучению. Четыре различных дозы ультрафиолетового света использовались в эксперименте. Расстояние между выставленными суспензиями и ультрафиолетовым источником света были 0,3 м. Продолжительность облучения была 15, 30, 45 и 60 минут. Интенсивность облучения – 83 Вт/см² и длина волны – 253,7 нм. Варианты штамма B. bassiana для облучения выращивались в течение 21 дня на агаре Сабуро с декстрозой. Личинки O. nubilalis были заражены сухим порошком, состоявший из мицелия и спор культуры гриба. В течение 10 дней, была оценена смертность зараженных личинок.

Было установлено, что даже непродолжительное облучение значительно влияло на вирулентность B.bassiana к личинкам O. nubilalis. Самый высокий уровень патогенности показал вариант штамма с облучением в течение 45 минут. Радиальный рост ультрафиолетовых вариантов понижался с увеличением времени облучения. Лучшей способностью расти обладал неосвещенный штамм и худшей – штамм с облучением в течение 60 минут. Различие между этими двумя вариантами было существенно. Опыт показал, что суспензия спор штамма гриба Beauveria bassiana, подвергавшаяся облучению в течение 15 и 30 минут, обеспечивает смертность личинок европейского кукурузного пилильщика. Для этих вариантов смертность в среднем составила 86,67%. Облучение в течение 45 минут ультрафиолетовым светом положительно влияет на вирулентность B. bassiana. Вариант штамма, облучавшийся в течение 45 минут имел самую высокую вирулентность после 10 дней и смертность личинок, которая составила 100,0%. Облучение штамма B. bassiana различной дозой ультрафиолетового света вызвали уменьшение способности гриба к росту. Легкое облучение вызывало небольшую задержку в росте вариантов, облучавшихся в течение 15 и 30 минут.

Интересно, что увеличивая дозы ультрафиолетового света можно добиться уменьшения вирулентности гриба для определенной дозы УФ-облучения (15-30) минут. Но гриб сохранил самый высокий уровень вирулентности в варианте C (45 минут). Когда продолжительность облучения увеличилась до 60 минут, вирулентность гриба падала.

Было обнаружено ранее, что повышающаяся доза ультрафиолетовых лучей увеличивает продуктивность вариантов гриба, но уменьшает патогенность, поэтому соотношение между патогенностью гриба и ультрафиолетовым облучением носит ассиметричный характер.

Ранее проведенные опыты, показали, что ультрафиолетовое облучение не понижает способность конидий к прорастанию, так экспозиция в течение 90 минут приводит к более быстрому росту и образованию большего количества спор гриба. Плодоношение гриба уменьшается после 4,5 часов ультрафиолетового облучения и после (30-48) часов полностью останавливается.

Согласно более ранним исследованиям выживание конидий гриба B. bassiana уменьшается с увеличением дозы ультрафиолетового света. С частотой мутаций это совпадает, но существует порог мутаций, при достижении которого количество мутантов падает. В проведенном опыте было обнаружено, что увеличение времени экспозиции уменьшает радиальный рост и скорость роста вариантов. Это находится в пределах выживания конидий, описанных выше.

Опыт с облучением штаммов B. bassiana, M.аnisopliae, M. flavoviride, Paecilomyces fumosoroseus в течение 0, 1, 2, 4 и 8 часов искусственным солнечным светом (295-1100) нм показал, что экспозиция в течение 2 и более часов отрицательно влияет на рост грибов.

Ранее исследовали влияние ультрафиолетового света на образование токсина B.bassiana. Опыт показал, что токсина образовывалось больше в результате мутации, вызванной 4-х часовой экспозицией под ультрафиолетовым светом. Ранее был проведен опыт с использованием четырнадцати изолятов B.bassiana, M. flavoviride и M. Anisopliae, которые были подвержены облучению в течение 4, 8, 16 и 24 часов под источником искусственного солнечного света. Жизнеспособность конидий у всех изолятов заметно уменьшалась с увеличением времени ультрафиолетовой экспозиции. Прорастание варьировалось в диапазоне (10-50)% после 24 часов облучения.

В целом, грибные мутанты часто образуются в результате ультрафиолетового облучения. Опыты показывают, что это реальная возможность использования ультрафиолетового облучения для получения новых штаммов B.bassiana. Опыты с прорастанием проделывались спустя 21 день после облучения. Этот срок кажется более чем достаточным для авторепарации поврежденных участков ДНК и стабилизации генетических изменений в образовавшихся после облучения вариантах.

Ранее проведенные исследования показали также изменения в характере питания под влиянием УФ, а именно переход от прототрофии к ауксотрофии. Выражалось это в продукции новых метаболитов таких, как ферменты, токсины и пигменты или их сокращении. Было отмечено различие в качестве и количестве грибных метаболитов.

Чтобы предупредить отрицательное влияние ультрафиолетового света на биопестициды, в их состав вносят ультрафиолетовые протекторы. Использование смачивающего агента помогает лучшему смешению и поддерживает влажность биопрепарата [13].

Изучали влияние на вирулентность к хлопковой тле споровой суспензии с добавлением ультрафиолетового протектора и смачивающего агента. К суспензии спор гриба Verticillium lecanii (титр – 10⁸ спор/мл) добавляли 1% монтмориллонитов (гидратированные натрий – кальций –алюминий – магний – силикат – гидроксиды), которые служили ультрафиолетовым протектором и 1% смачивающего агента (полиоксиэтилен), процент прорастания составил 80% после 30 минут облучения ультрафиолетом-С и 93% после 6 часов облучения ультрафиолетом-В. Монтмориллониты обладают способностью поглощать ультрафиолетовый свет в диапазоне (230-320) нм. Количество выживших спор с добавлением монтмориллонита было определено после облучения суспензии спор под ультрафиолетом с длиной волны 306 нм. Споровые суспензии были экспозированы на различное время под ультрафиолетом –С (100-280) нм, ультрафиолетом –В (280-320) нм или ультрафиолетом – А (320-400) нм. Споровая суспензия – контроль (без уф-протектора и смачивающего агента) была экспозирована под ультрафиолетом –А в течение 24 часов, процент прорастания составил 4%. При облучении в течение 1 часа под ультрафиолетом-В процент прорастания контроля составил 44%. Суспензия с монтмориллонитами показала следующий процент прорастания 93% после шести часов облучения и 51% после 10 часов. Для ультрафиолета-С процент прорастания контроля составил 53% при трех минутах облучения, и после семи минут облучения наблюдалась полная смертность спор. Однако, споровая суспензия с УФ-протектором поддерживала процент прорастания примерно 80% после 30 минут облучения. Поэтому, оптимизированная споровая суспензия с 1% монмориллонита и смачивающего агента достигала примерно 80% прорастания после тридцатиминутного облучения ультрафиолетом-С и 93% после шестичасового облучения под ультрафиолетом-В, ультрафиолет-А не подействовал на суспензию. Результаты опытов в теплице показали, что в варианте без обработки споровой суспензией численность хлопковой тли выросла в 14 раз по сравнению с исходной. В варианте с обработкой суспензией без монмориллонитов численность хлопковой тли выросла в 3 раза по сравнению с исходной. А в варианте с обработкой споровой суспензией с монтмороллонитами численность хлопковой тли уменьшилась на 60% от исходного количества. Было обнаружено, что споровая суспензия, содержащая монморилллониты, значительно подавляет популяцию хлопковой тли на период в две недели после опрыскивания. И в заключении, споровая суспензия V.lecanii с монмориллонитом и смачивающим агентом показала высокий защитный эффект против солнечного света в тепличных опытах [14].

Ультрафиолетовая радиация (ультрафиолет-A и ультрафиолет-B) – главный фактор в снижении вирулентности биопрепаратов, включающих в себя биомассу энтомопатогенного гриба Меtаrhizium anisopliae как биологического агента контроля численности насекомых. Исследования проводились, чтобы определить, влияют ли условия роста, то есть искусственные (агар или зерно риса) или естественные (зараженные насекомые) субстраты для образования конидий на устойчивость к ультрафиолетовому облучению и скорость прорастания конидий. Конидии двух изолятов M. anisopliae вар. anisopliae, выращенные на картофельно-декстрозном агаре с дрожжевым экстрактом и на убитых грибом личинках двух разновидностей насекомого Galleria mellonella и Zophobas morio, подвергались ультрафиолетовому облучению (УФ-В). Конидии обоих изолятов, которые были выращены на трупах насекомого, были значительно более чувствительными к ультрафиолетовой радиации, чем конидии, выращенные на картофельно-декстрозном агаре с дрожжевым экстрактом. Кроме того, конидии первого варианта прорастали медленнее, чем те же от культур, выращенных на картофельно-декстрозном агаре с дрожжевым экстрактом. С другой стороны, конидии, выращенные на насекомых-хозяевах, имели более высокую концентрацию гидролитических ферментов, чем конидии, выращенные на искусственной среде. Вирулентность и выживаемость конидий определяется также наличием запасных питательных веществ, накопленных во время конидиогенеза. Среди них важными являются углеводы и полиолы (высокомолекулярные спирты), наличие которых зависит от питательной среды. Чем больше таких эндогенных запасов, тем меньше время прорастания. Более быстрое прорастание было коррелированно с более высокой вирулентностью M. аnisopliae и Paecilomyces fumosoroseus.

Рост и конидиогенез гриба M. аnisopliae на различных субстратах (трупы насекомых, искусственные питательные среды и рисовое зерно) был различен, но была также различна и устойчивость к ультрафиолетовому облучению. Питательная среда влияла также и на морфологию колоний и пигментацию конидий. Например, изоляты, выращенные на среде Чапека, имели обильно растущий мицелий белого цвета и слабую споруляцию. Обильный рост и споруляция наблюдалась в изолятах, выращенных на среде Эмерсона, картофельно-декстрозном агаре (КДA), картофельно-декстрозном агаре с дрожжевым экстрактом (КДAД) и рисовом зерне. На среде Эмерсона конидии имели более темную пигментацию, чем на Чапеке, КДA и КДAД. Пигментация – есть фактор сопротивления солнечной ультрафиолетовой радиации. Субстрат и питательная среда также затрагивают физиологию и биохимию конидий. Метаболиты, представленные в конидиях M. аnisopliae, выращенных на искусственных субстратах, отличались от тех, что были представлены в конидиях, выращенных на трупах насекомых. Высокое содержание эритритола, маннита и глюкозы, но низкое содержание трегалозы были обнаружены в конидиях, выращенных на насекомых. Напротив, конидии, выращенные на агаре Сабуро с декстрозой, имели высокое содержание маннита, глюкозы, трегалозы и низкое содержание эритритола. Возраст культуры и экологические условия влияют на содержание полиолов и трегалозы в конидиях. Конидии с большими внутриклеточными концентрациями глицерина и эритритола прорастали быстрее. Накопление трегалозы в цитозоле клетки как запасного углевода защищает клетку от обезвоживания, низкой и высокой температуры, низкого рН и окислительного повреждения. Участие трегалозы в защите от ультрафиолетового излучения не изучено, но так как в результате действия на клетку ультрафиолета-А образуются активные формы кислорода, можно предположить, что трегалоза обеспечивает устойчивость конидий к ультрафиолетовой радиации. Поэтому низкое содержание трегалозы в конидиях могло бы быть одним из множества факторов, которые уменьшали бы уровень устойчивости к ультрафиолету-В, но, с другой стороны, большое количество трегалозы в конидиях, выращенных на искусственной питательной среде может увеличить уровень устойчивости к ультрафиолету-В и скорость прорастания. Пигментация конидий важна для устойчивости к искусственной солнечной радиации энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae. Исследовали, как влияет искусственная солнечная радиация на разные штаммы гриба Metarhizium anisopliae. Среди них: дикий тип, который имеет темно-зеленую окраску конидий, три группы мутантов с белыми, желтыми и фиолетовыми конидиями. Сравнивали степень инактивации и скорость прорастания конидий, экспозированных и неэкспозированных под источником искусственного солнечного света.

В дополнение к существенной инактивации конидий различных мутантов, экспозиция задержала в течение нескольких часов прорастание выживших конидий дикого типа и всех мутантов. Вообще, мутанты с белыми конидиями были более чувствительны к искусственной солнечной радиации, чем мутанты с фиолетовыми конидиями, которые более чувствительные, чем зеленые дикие типы. Существенное изменение в устойчивости к искусственному солнечному излучению наблюдалось среди мутантов в пределах каждой цветной группы, особенно среди мутантов с желтыми конидиями. Ревертанты (микроорганизмы, у которых в результате обратной мутации полностью или частично восстанавливаются признаки исходного (дикого) организма) с зелеными конидиями были получены от очень чувствительных к ультрафиолету мутантов с желтыми и фиолетовыми конидиями. Эти ревертанты имели уровень устойчивости к искусственному солнечному свету подобный дикому типу. Это доказательство того, что зеленая пигментация конидий служит фактором устойчивости к ультрафиолетовому облучению, что позволяет получать штаммы Metarhizium anisopliae толерантные к солнечной радиации [15].

Сравнивали восстанавливающие способности ДНК энтомопатогенных грибов В. bassiana, B.brongniartii, B.nivea, M.anisopliae, Paecilomyces farinosus, V.lecanii и грибов Aspergillus niger и Neurospora crassa. После облучения ультрафиолетовым светом суспензии спор грибов оценивали процент прорастания способом подсчета колониий образующих единиц. Известно, что эксцизионная репарация и фотореактивация позволяют восстановить исходную структуру ДНК и уменьшить задержку в прорастании конидий после облучения. Сравнивали между собой способы репарации (эксцизионную репарацию и фотореактивацию) энтомопатогенных грибов и грибов A.niger и N. crassa. В результате было обнаружно, что B. bassiana, и M. anisopliae – наиболее устойчивы к ультрафиолету. А также энтомопатогенные грибы не имеют всех вариантов репарации ДНК, доступных для грибов типа A. niger и N. crassa [16].