Некоторые распространенные типы хроматографии

В эксклюзионной хроматографии, которую также называют гель-фильтрацией, колонка заполняется микроскопическими пористыми гранулами сорбента. Когда смесь молекул растворяется в жидкости и наносится на колонку, большие молекулы не могут попасть внутрь поры и сравнительно быстро проходят между гранулами. В то же время, маленькие молекулы проникают внутрь пор и выходят из колонки позже. Таким образом иногда удается разделить белки только за счет их разного размера и собрать фракции, содержащие индивидуальные белки.

В аффинной хроматографии к гранулам сорбента ковалентно пришита специальная молекула, обычно антитело, которая способно специфически связывать очищаемый белок. Из всех белков, которые наносится на колонку, только один этот белок узнается и задерживается на сорбенте. Чтобы потом смыть очищенный белок с колонки, применяется буфер с высокой концентрацией соли или с высокой кислотностью, который разрушает взаимодействия между антителом и белком.

В ионообменной хроматографии, гранулы сорбента химически модифицированы так, чтобы нести постоянный положительный или отрицательный электрический заряд (обычно это модификация аминными или сульфатными группами). Заряд подбирается так, чтобы интересующий исследователей белок задерживался на колонке. Например, если заряд на сорбенте положительный, он будет связывать отрицательно заряженные белки. Эта техника называется «анионообменной хроматографией». Отрицательно заряженный сорбент связывает положительно заряженные молекулы (это называется «катионоообменной хроматографией»). После того, как белок отделили от примесей, его смывают с ионообменной смолы буфером с высокой концентрацией соли, которая разрушает ионные взаимодействия.

Этот набор разработан, чтобы продемонстрировать ученикам основные принципы эксклюзионной хроматографии, метода разделения молекул в зависимости от их размера. В нем используются окрашенные молекулы гемоглобина и витамина В12. Красно-коричневый гемоглобин намного больше, чем розовый витамин В12, и, следовательно, протекает через колонку намного быстрее. Ученики могут легко зрительно наблюдать за разделением этим двух молекул по мере их прохождения через колонку.

Принципы эксклюзионной хроматографии

М асса гранул, которой заполнена колонка, называется сорбентом. Пористые гранулы работают как молекулярные «сита» или «ловушки», задерживая маленькие молекулы внутри пор. Крупные молекулы не могут проникнуть внутрь пор и протекают между гранулами («исключаются»). Этот набор содержит восемь колонок, уже заполненных сорбентом, который способен эффективно разделять, или фракционируют» молекулы весом до 60 000 Да. Когда жидкость, содержащая разные молекулы, течет через колонку, молекулы весом до 60 000 Да проникают внутрь пор и задерживаются там. Чем меньше молекулы, тем медленнее они проходят через слой сорбента. Молекулы с молекулярным весом больше чем 60 000 Да не способны попасть внутрь гранул и очень быстро протекают между ними. Таким образом, 60 000 Да это так называемый предел проникновения или эксклюзионный предел колонки.

Образующая подвижную фазу жидкость, в которой растворены биомолекулы, называется буфером. Смесь разделяемых биомолекул называется образцом. Образец наносится на поверхность сорбента, и биомолекулы фильтруются через гранулы сорбента или вокруг них, в итоге вытекая через маленькое отверстие на дне колонки. Чтобы процесс разделения прошел до конца, после нанесения образца сверху дополнительно наливается буфер. Вытекающая из колонки жидкость последовательно собирается в пробирки, по определенному числу капель в каждую. Таким образом, каждая пробирка содержит определенную фракцию. Собранные в начале фракции содержат крупные молекулы, которые не задерживаются на колонке. Маленькие молекулы, способные проникать внутрь гранул сорбента, выходят в более поздних фракциях.

В этой лабораторной работе разделяются две молекулы – гемоглобин и витамин В12. Коричневый гемоглобин имеет молекулярный вес 65 000 Да и не способен проникнуть в поры используемого сорбента. Гемоглобин быстро протечет через колонку и появится в первых собранных фракциях. Витамин В12 имеет молекулярный вес 1 350 Да и разделяется на колонке. Молекулы витамина В12 проникают внутрь гранул сорбента и временно задерживаются там. В результате, они будут проходить через колонку гораздо медленнее и появятся в более поздних фракциях. Приведенная на следующей странице схема иллюстрирует разделение крупных и маленьких молекул в процессе эксклюзионной хроматографии.