Некоторые распространенные типы хроматографии

В эксклюзионной хроматографии, которую также называют гель-фильтрацией, колонка заполняется микроскопическими пористыми гранулами сорбента. Когда смесь молекул растворяется в жидкости и наносится на колонку, большие молекулы не могут попасть внутрь поры и сравнительно быстро проходят между гранулами. В то же время, маленькие молекулы проникают внутрь пор и выходят из колонки позже. Таким образом иногда удается разделить белки только за счет их разного размера и собрать фракции, содержащие индивидуальные белки.

В аффинной хроматографии к гранулам сорбента ковалентно пришита специальная молекула, обычно антитело, которая способно специфически связывать очищаемый белок. Из всех белков, которые наносится на колонку, только один этот белок узнается и задерживается на сорбенте. Чтобы потом смыть очищенный белок с колонки, применяется буфер с высокой концентрацией соли или с высокой кислотностью, который разрушает взаимодействия между антителом и белком.

В ионообменной хроматографии, гранулы сорбента химически модифицированы так, чтобы нести постоянный положительный или отрицательный электрический заряд (обычно это модификация аминными или сульфатными группами). Заряд подбирается так, чтобы интересующий исследователей белок задерживался на колонке. Например, если заряд на сорбенте положительный, он будет связывать отрицательно заряженные белки. Эта техника называется «анионообменной хроматографией». Отрицательно заряженный сорбент связывает положительно заряженные молекулы (это называется «катионообменной хроматографией»). После того, как белок отделили от примесей, его смывают с ионообменной смолы буфером с высокой концентрацией соли, которая разрушает ионные взаимодействия.

Этот набор разработан, чтобы продемонстрировать ученикам основные принципы эксклюзионной хроматографии, метода разделения молекул в зависимости от их размера. В нем используются окрашенные молекулы гемоглобина и витамина В12. Гемоглобин (темно-красный) намного больше, чем витамин В12 (розовый) и, следовательно, протекает через колонку намного быстрее. Ученики могут легко зрительно наблюдать за разделением этим двух молекул по мере их прохождения через колонку.

Принципы эксклюзионной хроматографии

С овокупность гранул, которыми заполнена колонка, называется сорбентом. Пористые гранулы работают как молекулярные «сита» или «ловушки», задерживая маленькие молекулы внутри пор. Крупные молекулы не могут проникнуть внутрь пор и протекают между гранулами («исключаются»). Этот набор содержит восемь колонок, уже заполненных сорбентом, который способен эффективно разделять, или «фракционировать», молекулы весом до 60 000 Да. Когда жидкость, содержащая разные молекулы, течет через колонку, молекулы весом до 60 000 Да проникают внутрь пор и задерживаются там. Чем меньше молекулы, тем медленнее они проходят через слой сорбента. Молекулы с молекулярным весом больше чем 60 000 Да не способны попасть внутрь гранул и очень быстро протекают между ними. Таким образом, 60 000 Да это так называемый предел проникновения или эксклюзионный предел колонки.

Жидкость, в которой растворены биомолекулы, образующая подвижную фазу, называется буфером. Растворенная в жидкости смесь разделяемых биомолекул называется образцом. Образец наносится на поверхность сорбента, и биомолекулы фильтруются через гранулы сорбента или вокруг них, в итоге вытекая через маленькое отверстие на дне колонки. Чтобы процесс разделения прошел до конца, после нанесения образца сверху дополнительно наливается буфер. Вытекающая из колонки жидкость последовательно собирается в пробирки, по определенному числу капель в каждую. Таким образом, каждая пробирка содержит определенную фракцию. Собранные в начале фракции содержат крупные молекулы, которые не задерживаются на колонке. Маленькие молекулы, способные проникать внутрь гранул сорбента, выходят в более

п оздних фракциях. В этой лабораторной работе разделяются две молекулы – гемоглобин и витамин В12. Коричневый гемоглобин имеет молекулярный вес 65 000 Да и не способен проникнуть в поры используемого сорбента. Гемоглобин быстро протечет через колонку и появится в первых собранных фракциях. Витамин В12 имеет молекулярный вес 1350 Да и разделяется на колонке. Молекулы витамина В12 проникают внутрь гранул сорбента и временно задерживаются там. В результате, они будут проходить через колонку гораздо медленнее и появятся в более поздних фракциях. Приведенная ниже схема иллюстрирует разделение крупных и маленьких молекул в процессе эксклюзионной хроматографии.

Образец – гемоглобин и витамин В12

Гемоглобин

Гемоглобин, белок красных кровяных клеток (эритроцитов) переносит кислород из легких ко всем тканям нашего тела. В нашей работе используется бычий гемоглобин. Использование бычьего (а не человеческого) гемоглобина предотвращает потенциальную угрозу здоровью, возникающую при использовании продуктов, полученных из человеческой крови. Гемоглобин состоит из четырех полипептидных цепей, вместе образующих большой глобулярный белок. Название «гемоглобин» происходит от слова «гем» - так называется присоединенная к белку железо-содержащая молекула, которая непосредственно связывает кислород. Из-за наличия иона железа белок приобретает темно-красный цвет. Родственный гемоглобину белок миоглобин содержится в мышцах и доставляет им кислород. Активные мышцы, которым для работы нужно много кислорода, окрашены в темно-красный цвет из-за высокого содержания миоглобина. Примером может служить «темное» мясо курицы.

Г емоглобин это основной компонент эритроцитов, или красных кровяных клеток, которые переносят кислород в нашем теле. Красный цвет эритроцитов также связан с железо-содержащим гемом. На разных стадиях развития организма производятся разные типы гемоглобина. Эмбриональный гемоглобин имеет более высокое сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого человека. Так как эмбрион получает кислород от своей матери, важно, чтобы материнский гемоглобин легко мог передавать кислород гемоглобину ребенка. Именно поэтому врачи рекомендуют женщинам воздерживаться от интенсивных физических упражнений во время беременности: при больших физических нагрузках кислорода в тканях становится очень мало, что вызывает конкуренцию за кислород между материнскими тканями и тканями ребенка.

Гемоглобин может связывать не только кислород, но и угарный газ (CO). Сродство (аффинность) к угарному газу у гемоглобина даже выше, чем к кислороду. Угарный газ вытесняет связанные с гемоглобином молекулы кислорода, и организм задыхается.

Организм может приспосабливаться к изменениям окружающей среды, которые требуют поступления повышенного количества кислорода. В горах, где кислорода в воздухе меньше, в организме человека производится больше красных кровяных клеток. Это увеличивает количество гемоглобина в крови, а следовательно, и количество доставляемого тканям кислорода. Спортсмены тренируются в горах, чтобы увеличить количество красных кровяных клеток в крови, что необходимо для того, чтобы выдерживать сверхвысокие нагрузки.

Серповидноклеточная анемия это наследственное заболевание, вызванное мутацией в гене гемоглобина. Одна мутация в гене, кодирующем гемоглобин, приводит к изменению аминокислотной последовательности белка. Из-за этого нарушается трехмерная структура полипептидов, образующих белок, они «слипаются» вместе, образуя плотный агрегат. Из-за наличия таких измененных молекул гемоглобина эритроциты приобретают искаженную, серповидную форму. Серповидные эритроциты не могут так же свободно, как круглые проходить через капилляры. Это приводит к ухудшению снабжения тканей кислородом, что выражается в постоянной очень сильной усталости. Иногда болезнь может быть смертельной. Поскольку серповидноклеточная анемия – наследственное заболевание, вызванное мутацией в последовательности гена, в настоящее время его невозможно вылечить. Тем не менее, облегчение симптомов возможно при частых переливаниях крови от людей с нормальным гемоглобином и нормальными эритроцитами.

Серповидноклеточная анемия возникает, когда человек наследует две копии мутантного гена (от обоих родителей). Люди с серповидноклеточным признаком унаследовали только одну мутантную копию гена (от одного родителя) . Наличие одной мутантной копии гена может являться эволюционным преимуществом. В Африке мутация серповидноклеточности часто встречается в районах, где распространена малярия. Малярия это тяжелая болезнь, вызываемая переносимым комарами одноклеточным паразитом. Паразит поражает и уничтожает красные кровяные клетки, но он неспособен инфицировать эритроциты, содержащие мутантный гемоглобин. Таким образом, серповидноклеточный признак придает резистентность к малярии и является эволюционной адаптацией. К сожалению, экспрессия двух копий такого гена вызывает слишком тяжелые последствия, причем больные серповидноклеточной анемией особенно тяжело переживают малярию.