Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю.

Контрольные вопросы

1. Каково значение коллекций культур микроорганизмов и какие существуют методы хранения микроорганизмов?

2. Как определить чистоту выделенных культур?

3. Как провести оценку морфологических и цитологических свойств выделенных культур?

4. С помощью каких воздействий можно влиять на рост и развитие микробной популяции?

5. Назовите основные группы антибиотиков, образуемых микроскопическими грибами.

6. Какие антибиотики образуются эубактериями?

7. Как по макроморфологическим признакам отличить Basillus, Actinomyces, Fungi?

Лабораторная работа № 6-7

«Определение концентрации антибиотика методом диффузии в агар»

Тема занятия: Определение концентрации антибиотика методом диффузии в агар

Цель работы: на основе знаний методологии проведения микробиологического контроля активности антибиотиков диффузионным методом научиться применять его на практике и рассчитывать содержание антибиотиков в растворе, биологических жидкостях и тканях.

Актуальность темы: Известно, что антибиотики, полученные биотехнологическими методами, составляют значительную часть ЛС на фармацевтическом рынке как в нашей стране, так и за рубежом. Иногда часть такой продукции присутствует в виде различных фальсификаций, которые представляют серьезную опасность для здоровья потребителей. Провизор должен знать особенности биотехнологического производства антибиотиков, а также уметь определять качество и количество целевого продукта, то есть, осуществлять контрольные функции по безопасности и эффективности предлагаемых антибиотиков.

Задачи обучения:

• освоение правил работы в лаборатории с биообъектами;

• проведение оценки активности антибиотиков в растворе:

• измерение зон задержки роста тест-микроба;

• построение графической зависимости дозы антибиотика от величины диаметра зоны задержки роста тест-микроба для стандартных и опытных растворов антибиотиков;

• использование графической зависимости и стандартной таблицы для расчета активности (концентрации) антибиотиков.

Материальное обеспечение работы

• пробирки стерильные объемом 20 мл;

• чашки Петри стерильные;

• пипетки стеклянные объемом от 1 до 10 мл;

• стерильные цилиндры из алюминия или нержавеющей стали;

• пинцет стерильный;

• суспензия тест-микроба;

• стандарт антибиотика;

• агаризованная питательная среда;

• стандарты мутности;

• стерильный физиологический раствор.

• термостат;

• ламинарный шкаф;

• водяная баня или СВЧ-печь для расправления агаризованной питательной среды;

• весы аналитические;

• столик с уровнем.

Методика определения активности антибиотика с использованием стандартной кривой.

Подготовительный этап. Подготовка чашек со средами и тест-микробом. Определение концентрации антибиотика можно проводить на двух или одном слое питательной среды, разлитой в чашки Петри. Для нижнего слоя используют «голодные» незасеянные среды, для верхнего слоя агаризованную среду засевают соответствующим тест-микробом. Каждому антибиотику соответствует среда с определенным содержанием аминного азота.

Питательную среду заражают взвесью соответствующего тест-микроба. Для этого в предварительно расплавленную и охлажденную до 48-50 ºС агаризованную среду вносят вегетативные клетки (Staphylococcus aureus 209P, Candida albicans и т.д.) или взвесь спор (Bacillus cereus, Bacillus subtilis). О способах выращивания и хранения тест-культур см. в «Государственной фармакопее».

Посевная доза тест-микроба должна быть предварительно установлена для каждой серии среды в пределах цифр, указанных для определения активности антибиотиков в ГФ.

Приготовление рабочих растворов стандарта антибиотика и испытуемого материала. Для приготовления раствора стандарта антибиотика точную навеску растворяют в соответствующем растворителе из расчета 1 мг в 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор). Дальнейшие растворы готовят путем разведения основного раствора до нужной концентрации.

Порядок выполнения работы

В связи с тем, что линейную зависимость между концентрациями и величиной зон задержки роста тест-микроба обнаруживают только в определенном интервале концентраций, растворы стандарта антибиотика должны быть подобраны. Для стандарта для каждого антибиотика определяют концентрацию раствора, которая обеспечивает образование оптимальных зон задержки тест-культуры (контрольная концентрация). Такой концентрацией для бензилпенициллина является 1 ЕД/мл, для олеандомицина – 4 мкг/мл, эритромецина – 1 мкг/мл и т.д. В стандартных условиях опыта при применении контрольных концентраций величина зон подавления роста колеблется в пределах 16-18, 17-19 мм. При приготовлении разведений испытуемого материала стремятся создать концентрации антибиотиков в пределах, близких к контрольной концентрации стандарта.

Занятие № 6. Приготовленные разведения стандарта антибиотика и испытуемого материала вносят в стерильные цилиндры из нержавеющей стали или алюминия, которые помешают на поверхность застывшей питательной среды чашек Петры (по 6 в каждой чашке), а также в лунки или на бумажные диски. Растворы стандарта и испытуемого образца вносят в количестве 0,1 л, чередуя стандартный и испытуемый растворы. Для каждого испытания используют не менее 3 чашек. Чашки инкубируют при 37 ^oC в течение 18 часов.

Занятие № 7. После инкубирования образцов в чашках Петри цилиндрики сбрасывают и измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба, образуемых испытуемыми растворами и проводят расчет активности исследуемых препаратов.

Расчет активности испытуемого препарата

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной кривой, для построения которой используют пять концентраций раствора стандартного препарата. Одна из концентраций является контрольной. По ней вносят поправки для всех других концентраций. Применяемые для построения кривой концентрации не должны отличаться от контрольной более чем в 2 раза. Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12). В 3 цилиндрика или лунки каждой чашки вносят раствор контрольной концентрации, в 3 другие – одну из взятых концентраций стандарта. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на 3 чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12х3=36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации для всех чашек и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной для 3 чашек с отдельными концентрациями, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если поправка отрицательная.

В процессе выполнения работы требуется:

• измерить диаметр зон подавления роста тест-микроба на чашках Петри при внесении различных концентраций растворов антибиотика-стандарта и построить график зависимости диаметра зоны подавления роста тест-микроба от концентрации антибиотика;

• измерить диаметр зон подавления роста тест-микроба на чашках Петри при внесении растворов испытуемого антибиотика и рассчитать концентрацию с использованием:

а) полулогарифмической сетки с нанесенным на ней графиком стандарта антибиотика;

б) стандартной таблицы расчета активности (концентрации) антибиотика;

• в предложенном варианте задания с учетом исходных данных рассчитать разведение стандарта антибиотика и использовать этот результат при расчете концентрации испытуемого раствора (примеры расчетов приведены в приложении).

По окончании работы необходимо оформить протокол по следующей схеме: тема, цель, методика, график зависимости активности стандарта антибиотика от диаметра зон угнетения роста, расчет активности испытуемого раствора по логарифмической сетке, расчет активности испытуемого раствора с использованием стандартной таблицы для расчета активности антибиотиков, выводы (указать, соответствует ли заявленная концентрация полученным результатам эксперимента по предложенной задаче).