Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю и представить простерилизованные питательные среды в чашках Петри и в пробирках.

Информационно-дидактический блок

Стерилизация – обеспложивание, т. е. полное уничто­жение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах.

Физические методы стерилизации. 1. Прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки. Данный способ применяется ограниченно, например, для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, пинцетов.

2. Стерилизация сухим жаром, или суховоздушная стерилизация в сушильном шкафу (пе­чи Пастера). Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165-180°С воздуха. При более высокой температу­ре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется больший срок стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стек­лянную посуду: чашки Петри, пробирки, пипетки и др.

3. Стерилизация паром под давлением в ав­токлаве. Один из наиболее эффективных методов стерилизации, который широко применяется не только в микробиологической практике, но ив клинической медицине. Работа с автоклавом требует точного выполнения специальной инструкции и соблюдения правил безопасности. Многие питательные среды, перевязочный материал, белье стерилизуют при давлении 1 атм в течение 15-20 мин, питательные среды с углеводами - при 0,5 атм в течение 15 мин, а обеззараживание инфицированного материала производят при 1,5-2 атм в течение 20-25 мин. Максимальную температуру пара измеряют максимальным термометром, который помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. В некоторых случаях используют хими­ческие вещества с определенной температурой плавления: бен­зонафтол (110°), бензойную кислоту (120°С).

Таблица. Соотношения между давлением, температурой и продолжитель­ностью стерилизации в автоклаве

Давление пара, атм	Температура, °С	Время стерилизации, мин
0 0,5 1 1,5 2	100 111 121 127 133	30-60 (дробно) 20-30 15-20 15-20 15

4. Стерилизация текучим паром в аппарате Коха или в автоклаве. Данный вид стерилизации (при незавинченной крышке и открытом выпускном кране) основан на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных клеток. Он применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал не выдерживает высокой температуры, например питательные среды с витаминами, углеводами. Для полного обеспложивания применяют принцип дробной стерилизации, т. е. стерилизуют материал при 100°С (или 80-90°С) в течение 20-30 мин 3 дня подряд. При этом вегетативные клетки поги­бают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Последующее двукратное прогревание обеспечивает достаточно надежную стерильность материала.

5. Тиндализация. Дробная стерилизация материалов при 58-56°С в течение часа 5-6 дней подряд. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.).

Питательные среды. Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Пи­тательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения мик­роорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.

По составу среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. Естественные питатель­ные среды — это натуральный продукт животного или ра­стительного происхождения — молоко, яйца, овощи, жи­вотные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ (пептон, аминопептид, дрожжевой и кукурузный экстракты). Синтетические среды содер­жат определенные химические соединения в точно ука­занных концентрациях. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые играют роль катализаторов мета­болических процессов, главным образом витаминов группы В, никотиновой кислоты и др.

По консистенции среды бывают жидкие, полу­жидкие, плотные, сыпучие и сухие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических осо­бенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно использу­ют для хранения культур, плотные – для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагно­стических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Сыпучие среды обычно используют для храпения по­севного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним отно­сят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. В качестве уплотнителей в на­стоящее время обычно используют агар, реже желатин и силикагель. Агар — полисахарид, выделенный из мор­ских водорослей. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ни­же, не используемые микроорганизмами в качестве пи­тательного субстрата. Несколько циклов плавления и за­твердевания не влияют на способность агара образовы­вать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Агар к средам добавляют в количестве 0,5% - для полужидкой среды и в количестве 1,5-2% - для плотной среды. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%).

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение биотехнологии как науке.

2. Дайте классификацию питательных сред.

3. Какие требования предъявляются к питательным средам?

4. Какие методы стерилизации применяются для питательных сред?

5. Какие методы культивирования Вы знаете?

6. Каким методом осуществляется культивирование на твердых и полутвердых питательных средах?

Лабораторная работа № 2

«Отбор почвенных проб различных регионов. Приготовление почвенной суспензии и высев на агаризованные среды. Культивирование микроорганизмов в оптимальных для разных родов и видов условиях»

Тема занятия: Отбор почвенных проб различных регионов. Приготовление почвенной суспензии и высев на агаризованные среды. Культивирование микроорганизмов в оптимальных для разных родов и видов условиях.

Цель: Освоить технику приготовления почвенной суспензии и высева на твердую агаровую среду в чашках Петри для выделения колоний микроорганизмов как отдельных объектов.

Задачи обучения:

• Знать составы жидких, твердых и полутвердых питательных сред

• Знать технику взятия материала для исследования.

• Знать технику высева исследуемого материала на питательную среду

• Знать оптимальные условия культивирования для разных видов микроорганизмов.

ЗАДАНИЕ 1. Приготовить посевной материал – почвенную суспензию.

• Взвешивают 1 г почвы, специально отобранной в различных регионах страны и хранящейся в лаборатории в холодильнике, и вносят в колбу со стерильной водой. Колбу встряхивают на качалке или шуттеле 15-20 мин до получения равномерной суспензии и вымывания спор микроорганизмов из почвенных комочков.

• Приготовленные ранее матрацы с агаризованной средой помещают на водяную баню для расплавления среды, которую далее охлаждают до 50-70 ºС и разливают в чашки Петри по 15-20 мл при диаметра чашек 90-100 мм соответственно. Чашки с застывшим агаром помещают в стерильный бокс, немного приоткрывают крышки и подсушивают в течение 20-30 мин, чтобы избежать образования сплошного газона растущих микроорганизмов.

ЗАДАНИЕ 2. Провести высев почвенной суспензии на агаризованную питательную среду.

• Полученную суспензию спор разводят в стерильной воде от 1:10 до 1:10,8 и по капле наносят стерильной пипеткой на поверхность агаризованной среды в чашки Петри. Стерильным шпателем растирают каплю по всей поверхности среды. При этом крышку при­держивают левой рукой и одновременно вращают чашку, не отрывая ее от стола. После инкубации посева появляется равномерно сплошной рост бактерий. Для выделения микроорганизмов необходимо, чтобы на одной чашке вырастало около 100 колоний, достаточно удаленных друг от друга, поэтому рабочими разведениями чаще всего являются 1:10,5-1:10,7.

• Засеянные чашки помещают в термостат. Для выделения бактерий и грибов их обычно инкубируют при 24 ºС, для выделения актиномицетов – при 28 ºС. Для выделения термотолерантных или психрофильных микроорганизмов используют специальные условия. Так, для выделения редких актиномицетов рода Micromonospora чашки инкубируют при 37 ºС 2-3 дня с последующим доращиванием в течение 7-12 сут. Такой же срок допустим для большинства культур, при этом в течение всего срока роста чашки просматривают.