§ 3, Устойчивость растворов вмс и методы осаждения белков

Основным фактором термодинамическвй'усТбйчИВости рас­творов биополимеров является их высокая гидрофильность. В молекулах белков гидратированы карбоксильные и амино­группы, пептидные связи и другие полярные группы, которые входят в состав макромолекул.

Степень гидратации белков определяют различными физико-химическими методами (калориметрическим, кондуктометри-ческим, методом э. д. си т. д.). Данные экспериментов по изу­чению гидратации белков показали, что наиболее прочно свя­зан с макромолекулами монослой растворителя, однако энергия взаимодействия различных участков молекул белков с водой распространяется на более отдаленные участки водной среды.

С~ "Для растворов биополимеров не характерно явление коа- уляции. Белки из раствора можно выделить с помощью кон- центриров^тШх "растворов солеи, зтот процесс называется высаливанием. Обычно для высаливания используют растворы Na₂SO₄, (KlHj)₂SO₄, соли магния и фосфаты. Высаливание наиболее jjjj)rj^TiiBHf)_j3^^ Меха-

низм процесса высаливания состоит в том, что ионы солей при­тягивают к себе молекулы воды, уменьшая тем самым коли­чество воды, взаимодействующей с белком, поскольку при высоких концентрациях солей количество ионов огромно по сравнению с заряженными группами белков. А так как рас­творимость белков в воде зависит от образования гидратной оболочки вокруг гидрофильных ионных групп, перемещение молекул воды к другим ионам снижает^а"сТ1Т)римосТБ'~бе#ка, и он выпадает в осадок.

Примеаяя-расзаюрьі_шл£Й 4шщнньіх.- концентраций.,, мож­но последовательно осаждать б^лки. .по фракциянггСначала осаждаются фракщщс~б^льщай^мол£і^.ярной_і массой, а в са­мых концентрцрован'ньі*-р^твюгзах — наиболее легкие фрак­ции. Методом высаливания осаждаются белки сыворотки

(Я)

<£)

крови. Глобулины выпадают в осадок в полунасыщенном, аль­бумины — в насыщенном рас­творе сульфата аммония.

Белки осаждаются из водных растворов И с ПОМОЩЬЮ ВОДОатни- Рис. 67. Схема коацервации. мающих растворителей — мети­лового и этилового спиртов, ацетона. На растворимость белков в этих растворителях существенно влияют добавки солей, изменяющих рН. Высаливание обычно проводят при понижен­ных температурах, чтобы не вызвать денатурацию белков. На таком сочетании действия этилового спирта, солей и охлажде­ния (до —5 ⁰C) основаны способы фракционирования белковых смесей по Кону. Из сыворотки крови этим методом выделено свыше 12 белков.

По влиянию на процесс высаливания анионы и катионы можно расположить в лиотропные, ряды:

SO^- > F- > CrO^ > CH₃COO- > Cl- > Br > [- > CNS~;

Li⁺> Na⁺> К+> Mg²+> Ca²+. '

Процесс высаливания по своей природе и механизму су­щественно отличается от коагуляции электролитами. Коагуля­ция происходит при небольших концентрациях электролитов, а высаливание — в очень концентрированных растворах. Вли­яние природы ионов на процессы коагуляции и высаливания противоположно и связано с их способностью к гидратации..

Осаждение белков проводится в мягких условиях без на­рушения их нативной природы. После отмывки от электроли­тов белки могут быть снова переведены в растворенное состоя­ние.

В настоящее время в лабораторной практике для разделе­ния и выделения различных белков широко применяется метод ультрацентрифугирования (см. гл. VI).

Коацервация. При снижении растворимости в растворах высокомолекулярных соединений может происходить явление коацервации, заключающееся в слиянии водных оболочек нескол ь к и X части че к- (рис. 67). ^f^J^^^^^ag&

Капли"или слои,-образующиеся в результате коацервации и обогащенные дисперсной фазой, называются коацерватами. Частички высокомолекулярного соединения, входящие в со­став коацерватных капель, по-видимому, отделены друг от Друга тонкими гидратными оболочками. Об этом свидетель­ствует обратимость процесса коац^едвашш. При изменении условий, вызвавших коацервацию (уменьшение концентрации Электролита, изменение рН и температуры) коацерватные кап­ли исчезают и система переходит в однофазную. В то же время, изменяя условия в сторону усиления процесса дегидратации макромолекул, можно вызвать разрушение коацерватных ка­пель и полное осаждение растворенного вещества.

При смешивании растворов различных полимеров возни­кают комплексные коацерваты. Мелкие коацерваты могут сли­ваться в более крупные и в конце концов система может рас­слоиться на два жидких слоя, один из которых обогащен поли­мером, а другой обеднен. При комплексной коацервации по су­ществу происходит высаливание одного полимера другим.

Коацервация, особенно комплексная, играет огромную роль в биологических процессах, совершающихся в цитоплаз­ме. Некоторые физико-химические свойства коацерватов сходны со свойствами протоплазмы. В теории возникновения жизни на Земле, предложенной А. И. Опариным, придается большое значение образованию комплексных коацерватов из различных высокомолекулярных соединений, которое прош> ходило в водах первичной земной гидросферы.

Денатурация. В нативном состоянии все белки обладают характерной структурой и определенными физико-химичес­кими и биологическими свойствами. Под влиянием внешних факторов. — изменения температуры, рH среды, облучения, воздействия химических веществ — многие белки теряют свою структуру и свойства. В первую очередь ^изменяются их растворимость и биологическая активность. Это" явление на­зывается денатурацией.

При денатурации белков разрушаются в основном неко- валентные связного не затрагиваются пептидные. Структура становится беспорядочной."Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная ^потеря белком его биологической активности (ферментативной, анти- генной, гормон альгоиУ." действии и быстром устранении денатурирующего агента возможен обратимый процесс — полное восстановление нативной струк- туры и исходных свойств белка.

С термодинамической точки зрения процесс денатурации характеризуется увеличением энтропии (нарушение упорядо­ченной структуры) и положительным значением энтальпии, т. е. процесс является эндотермическим.^днако в целом при температуре 273—283 К процесс" денатурации имеет отрица­тельные значения изобарно-изотермического потенциала (AG < < 0), а это свидетельствует о том, что при данных условиях он может протекать самопроизвольно.

Исследования показали, что добавление некоторых веществ к растворам белков снижает температурный интервал процесса денатурации. Вероятно, это связано с образованием активного комплекса белка с реагентом. В качестве таких реагентов при­меняются мочевина, гуанидин и др.

Для практических целей процесс денатурации проводят в мягких условиях (при низкой температуре, оптимальном значении рН и Др.). Например, при получении и хранении ферментов и других биологически активных веществ их пред­варительно денатурируют.

Явление денатурации широко используется в пищевой промышленности.