§ 6. Хроматографический метод анализа

Явление адсорбции лежит в основе хроматографического метода разделения, очистки, анализа и исследования веществ, который широко применяется в биологии, медицине и фарма­кологии.

Основоположником хроматографического анализа является русский ботаник М. С. .Цвет. В1903 г. он разделил раствор хлорофилла на 'отдс.Тьние "компоненты, пропуская его через стеклянную трубку, заполненную мелом. При этом пигменты расположились отдельными зонами в зависимости от своей адсорбционной способности..,.

Начиная с 30-х годов нашего столетия этот метод получил широкое распространение, что связано с развитием теории адсорбции и ионного обмена, а также синтезом различных адсорбентов. Одновременно совершенствовалась техника проведения анализа, разрабатывались и создавались различ­ные хроматографы.

Все хро мато графи чес кие системы состоят, как правило, из двух фаз. Одна из них — неподвижная, она может быть твердой, жидкой или состоять из твердой подложки, покрытой _ жидкостью. Вторая и$ааа»_подвижная/ обычно пропускается "II

через неподвижную, она может быть жидкой или газообраз­ной.

Фазы для хроматографического разделения подбирают та­ким образом, чтобы коэффициенты распределения компонен­тов в них были различными. Напомним, что коэффициент рас­пределения равен отношению концентраций данного компонен­та в разных фазах:

K =

Концентрация вещества в подвижной фазе

Концентрация вещества в неподвижной фазе"

В зависимости от физико-химических процессов хромато-трафическое разделение делится на такие виды:

1. Адсорбционная хроматография — установление адсорб­ционного равновесия между неподвижной твердой и подвиж­ной жидкой или газообразной фазами.

2. Противоточная хроматография —- равновесное распре­деление между двумя жидкими фазами.

3. Газожидкостная хроматография — равновесное распре­деление между неподвижной жидкой и подвижной газообраз­ной фазами.

4. Ионообменная хроматография — ионообменное равно­весие.

5. Аффинная хроматография — равновесное связывание макромолекулы с малой молекулой, к которой она проявля- ет высокую биологическую специфичность. I₄

В зависимости от метода, которым проводится разделение, различают колоночную, тонкослойную и бумажную хромато­графии.

Современная хроматография быстро развивается во мно­гих направлениях, каждое из которых позволяет решать опре­деленный круг специфических задач. Особо следует выделить метод газовой хроматографии (ГХ), который отличается бы­стротой проведения анализа и четкостью разделения компо­нентов. Он используется для определения микроколичеств большинства летучих органических и неорганических веществ и многих нелетучих веществ по продуктам их пиролиза.

Газовая хроматография применяется в различных отраслях промышленности — нефтяной, химической, пищевой, фарма­цевтической и др. Однако долгое время биологи и медики не уделяли ей должного внимания, считая, что биологические объекты недостаточно летучи. Успехи в разработке методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращения их в летучие соединения открыли широкие возможности для использования газовой хроматогра-' фии в биохимическом анализе. Она применяется для опреде­ления большинства компонентов биологических жидкостей и тканей: аминокислот, углеводов, нуклеиновых и жирных кислот, циклических соединений, спиртов, стероидов и т. д.

Сочетая метод газовой хроматографии с другими методами исследования — спектрофотометрией, масс-спектрометрией, ядерным магнитным резонан­сом, можно решать различные медико-биоло­гические задачи — определять и исследовать продукты метаболизма, изучать химический состав тканей, органов, клеток, проводить контроль загрязненности окружающей среды и т. д.

Рис. 47. Хрома-тограмма газо­вой смеси из трех компонен­тов.

При использовании газохроматографиче-ского метода разделение веществ происходит в результате различной адсорбционной способ­ности компонентов, находящихся в газообраз­ной фазе, на жидком или твердом адсорбенте.

Прибор для проведения анализа методом ГХ (рис. 46) состоит из хроматографической колонки с адсорбентом, через которую с постоянной скоростью пропускают газ-носитель (аргон, азот). В поток газа-носителя с помощью дозатора вводят пробу смеси исследуемых веществ; состав выходящего из колонки газа регистрирует детектор, сигнал которого записывает самописец.

Качественный и количественный анализы проводят по хроматограмме — кривой зависимости сигнала детектора от времени или от объема прошедшего через колонку газа-носи- теля (рис. 47), пики на кривой показывают количественное со- держание Определенных компонентов смеси. ~~

Колоночный вариант хроматографии применяется для раз­деления или очистки веществ, находящихся в жидкой фазе. Для этого на адсорбент, заполняющий колонку, наносят не­большой объем исследуемой жидкой смеси, которая прони­кает только в поверхностный слой сорбента. Затем колонку промывают соответствующим растворителем. При продвиже­нии растворителя происходит разделение смеси на индивиду­альные соединения, занимающие в колонке строго определен­ное положение. При дальнейшем пропускании растворителя индивидуальные соединения в виде раствора одно за другим выходят из колонки. Этот процесс называется элюированием} а жидкость, вытекающая из колонки,— элюатом. Элюат собирают отдельными порциями и определяют в них содержа­ние анализируемых веществ.

В биохимии и фармакологии часто применяют бумажную и тонкослойную хроматографию (TCX). В бумажной хромато­графии неподвижной фазой служит воздушно-сухая бумага, содержащая до 25 % воды. В качестве подвижной фазы приме­няют различные органические растворители, менее полярные, чем вода.

Раствор исследуемой смеси веществ наносят в виде капли на конец бумажной полоски. Бумагу высушивают. Конец ее ниже места нанесения капли опускают в ванну с растворите­лем. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги вместе с ним перемещаются растворенные вещества, которые непрерывно распределяются между двумя жидкими фазами — водой и растворителем. Разделение компонентов основано на различии их коэффициентов распределения,

Хроматографирование на бумаге проводят в атмосфере, насыщенной парами растворителя. После достаточного продви­жения фронта растворителя на бумаге процесс заканчивают и бумагу высушивают.

При разделении бесцветных веществ хроматограмму про­являют реактивом, образующим окрашенные соединения с ана­лизируемыми веществами. При этом на хроматограмме обра­зуется целый ряд цветных пятен, расположенных в определен­ном порядке. Так, для обнаружения ос-аминокислот часто применяется- нингидрин.

Для качественного анализа бумажных хроматограмм ис­пользуют способ «свидетелей», нанося на одну и ту же полоску бумаги пятно смеси исследуемых веществ и отдельно пятна веществ, содержание которых в смеси предполагается. После проявления хроматограммы сопоставляют положение пятен «свидетелей» с положением пятен неизвестных веществ.

Для количественного определения окрашенные пятна вы­резают, экстрагируют вещества соответствующими раствори­телями и определяют их концентрации спектрофотометричес-ким методом.

В методе тонкослойной хроматографии твердый адсорбент наносят на стеклянную пластинку. В качестве сорбентов при­меняются оксид алюминия, силикагели, гипс, целлюлоза. Растворители используются разной полярности. Разделение веществ основано также на различии их коэффициентов рас­пределения между двумя жидкими фазами.

В клинической практике метод TCX нашел применение для быстрого анализа крови и мочи на содержание лекарств, различных белков, аминокислот, продуктов метаболизма.

Методом тонкослойной хроматографии удается быстро и четко разделять и идентифицировать очень малые коли­чества неорганических веществ (от десятых и сотых долей до десятков микрограммов).

В фармацевтической промышленности метод TCX помогает контролировать ход синтеза лекарственных препаратов, оце­нивать их чистоту, определять стабильность.