§ 5. Особенности кинетики ферментативных процессов

Катализ играет важную роль в живой природе. Биологи­ческие катализаторы — ферменты (энзимы) — по своей ак­тивности во много раз превосходят неорганические катализа­торы. Молекулярная активность фермента — это количество молекул субстрата, превращенных одной молекулой фермен­та за одну секунду. В этих единицах молекулярная активность пепсина равна примерно 20, амилазы — 300, каталазы из печени лошади — 100 000, а холинэстеразы из электрического ската — 300 000. Ферменты — вещества белковой природЫ,\они управляют всеми биологическими функциями организма — ак- ^ тивным движением, ростом, размножением, пищеварением, ды- \^у ханием, синтезом и распадом различных соединений. Ферменты ^ ~ обезвреживают продукты обмена и выводят их из организма?] і В настоящее время известно свыше 2 000 ферментов и их активных центров. Большие успехи достигнуты в разработке методов получения ферментов в высокоочищенном состоянии, что дает возможность наладить промышленное производство препаратов ферментов, пригодных для медицинских целей. Разработаны простые и высокочувствительные приемы опре­деления активности ферментов в биологических жидкостях — крови, моче, ликворе, слюне, экссудатах. Они лежат в основе ряда лабораторных методов диагностики многих заболеваний. Следует отметить высокую чувствительность и специфичность методов химического анализа с помощью ферментов.

В последние годы оформилась новая область теоретической и практической медицины — медицинская энзимология. Она включает следующие разделы: а) энзимодиагностику — иссле­дование ферментов в биологических жидкостях и тканях с ди­агностической целью, а также для выяснения протекания па­тологического процесса и эффективности применяемой терапии; б) энзимотерапию — применение ферментов, их активаторов и ингибиторов с лечебной целью; в) использование ферментов для изучения патогенеза ряда заболеваний.

Главной особенностью ферментативных химических реак­ций, протекающих в организме, является их исключительно вы­сокая скорость, она в 10^е— 10¹² раз превышает скорость неката­литических реакций. Другой важной особенностью ферментов является их высокая специфичность, целенаправленность. Они ускоряют реакцию только между определенными суб­стратами и не оказывают влияния на другие вещества. Фер­ментативные реакции протекают в мягких условиях.

Первые исследования ферментов были направлены на изу­чение их строения и установление связи между их биологи­ческой активностью и структурой. Однако оказалось, что объяснить механизм действия ферментов гораздо сложнее, чем установить их строение. В настоящее время исследова­тели склоняются к выводу, что ответ на вопрос, как работают ферменты, требует также подробного изучения кинетики фер­ментативных реакций.

Установлено, что каталитическая активность фермента определяется его активным центром, формирующимся в ре­зультате специфического расположения определенных ^-групп полипептидной цепи. Пространственная структура активного центра предопределяет не только выбор субстрата, строение которого комплементарно этому центру по типу «замок—ключ», но и природу последующих превращений, приводящих к обра­зованию соответствующего продукта.

Связывание субстрата с активным центром осуществля­ется в результате образования специфических нековалентных связей, включающих гидрофобное и электростатическое взаи­модействия, а также водородные связи. При контакте с актив­ным центром субстрат оказывается в непосредственной бли­зости от специфических групп фермента, совместное действие которых дестабилизирует определенные связи субстрата, превращая его в более реакционноспособное промежуточное соединение, из которого затем образуются продукты реакции.

Действие активного центра фермента включает три эффек­та: 1) концентрационный; 2) ориентационный; 3) полифункци­ональный.

Сущность концентрационного эффекта в ферментативном катализе заключается в том, что фермент «вылавливает» мо­лекулы субстрата и концентрирует их на своей поверхности. При этом характерной особенностью фермента является то, что он собирает только «разноименные» молекулы (рис. 36,а), которые затем реагируют между собой. Концентрационный эффект ускоряет реакцию в сотни раз. Однако далеко не каж­дое столкновение между молекулами приводит к их взаимо­действию. Для того чтобы реакция произошла, молекулы должны столкнуться друг с другом определенными участками своих поверхностей, т. е. молекулы при столкновении должны быть соответствующим образом ориентированы друг отно­сительно друга (ориентационный эффект, рис. 36,6).

В обычных химических реакциях ориентация носит стати­стический характер, фермент же сам определенным образом ориентирует взаимодействующие молекулы и этим ускоряет реакцию еще в сотни раз. Именно поэтому первое, классиче­ское правило ферментативных реакций, сформулированное в конце XIX в. Э. Фишером, гласило: субстрат должен под­

ходить к своему ферменту, как ключ к замку. В дальнейшем это правило было модифицировано таким образом, чтобы учесть гибкость структуры белка: фермент «подстраивается» к субстрату, образуя с ним промежуточное соединение — фер­мент-субстратный комплекс.

Полифункциональный эффект активного центра состоит в одновременном или последовательном воздействии на моле­кулу субстрата нескольких атакующих групп фермента, что характерно только для биокатализаторов.

Все перечисленные эффекты в какой-то мере объясняют высокую скорость ферментативных реакций и их специфич­ность.

Уравнение Михаэлиса-Ментен. Много внимания ученые уделяют, как уже было сказано, исследованию кинетических закономерностей ферментативных реакций. В 1913 г. Л. Ми-хаэлиси М.Ментен вывели уравнение зависимости скорости ре­акции от концентраций фермента и субстрата. Они рассматри­вали обратимое ферментативное превращение одного субстрата и одного продукта. Из экспериментальных данных о зависимости скорости реакции от концентрации фермента и субстрата сле­довало, что при увеличении концентрации фермента скорость реакции растет линейно, а при увеличении концентрации суб­страта она увеличивается гиперболически, достигая предель­ной максимальной скорости (рис. 37). Это свидетельствовало о том, что фермент имеет конечное число участков, взаимодей­ствующих с субстратом. После заполнения всех участков даль­нейшего увеличения скорости не происходит.

Л. Михаэлис и М. Ментен высказали предположение, что фермент F, взаимодействуя с субстратом S₁ образует фермент­

субстратный комплекс FS, из которого затем освобождаются фермент и продукт Р:

ft, ft₂

F + S^UFS^F + P,

ft-1 ft-2

где ki, k__u к_г, fe_₂—константы скорости соответствующих ста­дий реакции.

Рассматривался случай, когда концентрация субстрата на­много больше концентрации фермента [S₀] ^> [F₀] и [Si^ л* IS₀]. Общее количество фермента определяется суммой:

[F,} = 1П+ [FSl

где IF] — концентрация свободного фермента; [FS] — кон­центрация фермента в комплексе.

Константа диссоциации субстрат-ферментного комплекса характеризует равновесие [FS] «=* [F] [SJ и равна: fe-x [F][S] ([FqI-[FS])[S] '"~ k_x " [FS] ~ [FS]

Скорость распада фермент-субстратного комплекса описы­вается кинетическим уравнением:

о = ft, [FS].

Л. Михаэлис и М. Ментен, объединив эти два выражения, получили следующую зависимость:

-Ж

которая носит название уравнения Михаэлиса— ^ л Ментен и показывает, что зависимость ско- | роста ферментативной реакции от концентра- | ции субстрата гиперболическая, а от концент- | рации фермента—линейная. Константа K_n, ° называется константой Михаэлиса; это важ- "§ ный параметр, характеризующий каждую пару | фермент — субстрат. _рИ

Уже упоминалось о высоких скоростях фер­ментативных ПрОцеССОВ, КОТОрЫе ОСуЩесТВЛЯ- _м"^_ь активно-ются в очень мягких условиях. В живом орга- сти фермента от низме все реакции должны протекать доста- рн среды, точно быстро, последовательно и согласованно. Если своевременно не поставляется необходимый субстрат или продукт реакции, могут возникнуть нарушения обмена веществ, проявляющиеся в виде заболеваний. Естественно, что метабо­лические нарушения возникают и в тех случаях, когда ско­рость физиологических процессов значительно выше, чем в норме.

Влияние рН на скорость ферментативных процессов. Для

каждого фермента существует определенное значение рН, при котором его действие оптимально (рис. 38). Значение оп­тимума рН различно у разных ферментов, например, для пеп­сина это кислая среда, для щелочной фосфатазы — щелочная. При проведении исследований с использованием ферментов необходимо поддерживать постоянное значение рН с помощью соответствующих буферных растворов.

Влияние рН на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и содержат большое количество ионогенных групп. Если функционирование фер­мента зависит от наличия некоторых специфических группи­ровок в его активном центре, то каждая из них в данных усло­виях должна находиться в определенном состоянии (неионизи-рованном или ионизированном). Нередко участвующие в ката­лизе ионогенные группы активного центра идентифицируют путем анализа зависимости активности фермента от рН и со­поставления полученных данных с известными величинами рК ионогенных групп белков.

Концентрация водородных ионов может влиять на действие ферментов и косвенным путем, поскольку многие ферменты, как и вообще белки, стабильны только в ограниченном интер­вале рН, чаще при нейтральных его значениях. Однако есть и исключения, например, пепсин стабилен в кислой среде и быстро инактивируется в нейтральных и щелочных растворах.

Многие ферменты являются конъюгированными белками, небелковый компонент которых относительно слабо связан с белком. Поскольку для ферментативной активности необ­ходимы оба компонента, то в условиях, вызывающих диссоци­ацию кофактора, происходит потеря активности. Подобная дис­социация часто является обратимой. Например, пероксидаза диссоциирует на два неактивных компонента в кислой среде, однако при рН = 7 ее активность восстанавливается.

Ингибирование ферментов. Скорость катализируемой фер­ментом реакции может быть замедлена специфическими инги­биторами, т. е. соединениями, которые, взаимодействуя с ферментами, препятствуют образованию нормального фер­мент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции. Некоторые ингибиторы ферментов являются для жи­вых организмов ядами, например KCN, H₂S, СО. Поскольку токсичность многих ядов обусловлена их ингибирующим дей­ствием на ферменты, ряд проблем токсикологии следует рас­сматривать с энзимологических позиций. Многие лекарствен­ные препараты также являются ингибиторами, поэтому разви­тие молекулярной фармакологии в значительной мере связано с исследованиями процессов ингибирования ферментов. Та­кого рода исследования позволяют получать весьма важную информацию о самих ферментах.

Обратимое ингибирование ферментов бывает трех типов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. Их раз­личают с помощью кинетического анализа.

Конкурентные ингибиторы способны обратимо связываться с активным центром фермента и конкурировать с субстратом за активный центр.

При неконкурентном ингибировании образование соедине­ния фермента с ингибитором происходит не на том участке фермента, с которым связывается субстрат.

При ингибировании бесконкурентного типа образуется обратимое соединение между ингибитором и фермент-субстрат­ным комплексом.

Таким образом, от обычных химических катализаторов фер­менты отличаются высокой субстратной специфичностью и ка­талитической эффективностью. Большинство ферментов дей­ствуют лишь на незначительное количество природных субстра­тов, которые превращаются в определенные продукты с высо­ким выходом.

Исследование механизмов ферментативных процессов пер­спективно не только для медицины. Применение высокоэф­фективных катализаторов в микробиологической, химической, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве даст ВОЗМОЖ-

ность интенсифицировать различные технологические про­цессы, увеличить выход продукции.

Практическое использование данных науки о ферментах позволит быстро и эффективно решать задачи Продовольствен­ной программы.