Приготування препаратів фіксованих і пофарбованих клітин

Фіксованими вважають клітини мікроорганізмів, у яких пе­рервані життєві процеси, але цілком збережена тонка структура. Пофарбовані фіксовані клітини і деталі їхньої будови різкіше виділяються на фоні препарату. Це полегшує вивчення форми, розмірів, внутрішніх елементів (ядра, оболонки, спор, вклю­чень), спрощує підрахунок кількості клітин. Фіксовані препара­ти звичайно розглядають з імерсією. Приготування таких пре­паратів має такі етапи: приготування мазка, висушування, фік­сація та фарбування.

Приготування мазка. На знежирене предметне скло нанести маленьку краплю очищеної води і петлею перенести в неї неве­лику кількість досліджуваного матеріалу, як для препарату «роздавлена крапля». Одержану суспензію рівномірно розподі­лити петлею або краєм покривного скла на площі 1–2 см² яко­мога тоншим шаром, щоб вона висихала майже відразу після приготування мазка.

Сушіння мазка. Найкраще сушити препарат при кімнатній температурі на повітрі. Якщо мазок висихає повільно, препарат можна злегка нагрівати у струмені теплого повітря, тримаючи скло високо над полум'ям пальника мазком догори. Цю опера­цію слід виконувати дуже обережно, не перегріваючи мазок, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація. Цей процес має на меті вбити мікроорганізми, тоб­то зробити їх безпечними, якщо вони патогенні; забезпечити найкраще прилипання клітин до скла, зробити мазок більш сприятливим до фарбування (мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі). Поширений спосіб фіксації – термічна оброб­ка. Для цього препарат треба тричі пронести через найгарячіше полум'я пальника, тримаючи предметне скло мазком догори. Не слід сильно перегрівати мазок, оскільки можуть статися грубі зміни зовнішнього вигляду клітини і внутрішніх клітинних структур (зморщування). Іноді застосовують хімічні способи фіксації: занурюють предметне скло з мазком у мензурку з 96 %-м етанолом на 15-20 хв, з безводним метанолом на 3-5 хв, з розчином Никифорова на 15-20 хв, із сумішшю 96 %-го ета­нолу і 40 %-го формаліну (співвідношення 95:5) на 2 хв. Можна фіксатор наливати безпосередньо на мазок і витримувати зазна­чений час. Після закінчення фіксації мазок обережно промива­ють легким струменем з дистильованої води й фарбують.

Фарбування. Розрізняють прості, складні і диференціальні способи фарбування мікроорганізмів. При простому фарбуванні частіше використовують один барвник і профарбовують усю клітину. Це дає можливість чітко визначити форми і розміри клітин. Складне фарбування передбачає застосування двох або декількох барвників, наприклад, діагностичне визначення відно­шення бактерій до фарбування за Грамом. Диференціальне фар­бування засноване на індивідуальному відношенні біологічних структур клітин до різних барвників (фарбування спор, оболон­ки, ядра капсул, метахроматина й ін.).

Для фарбування простим способом фіксований препарат вмістити на паралельні скляні мости­ки, які лежать на стінках кристалізатора, і облити з піпетки кількома краплинами розчину вибраного барвника (фуксину, метиленового синього тощо). Слід зверта­ти увагу на те, щоб кінець піпетки не торкався мазка. Тривалість фарбування – від декількох секунд до 1-3 хв.

Фарбувати мазок фуксином Пфейффера необхідно 1-2 хв, а лужним метиленовим синім – 3-5 хв. Після забарвлення препарат промивають водопровідною водою до зникнення струмочків барвника, висушують фільтрувальним папером і мікроскопують.

У повсякденній мікробіологічній практиці найчастіше використовуються основні барвники: фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний (дають червоне забарвлення), метиленовий та толуїдиновий синій (голубе, синє), генціанвіолет, метиленовий фіолетовий (фіолетове), хризоїдин, везувін (жовто-коричневе), брильянтовий зелений, малахітовий зелений (зелене) та інші.

Необхідно сте­жити, щоб під час фарбування розчин барвника на мазку не під­сихав, і у разі потреби доливати нові порції. Після закінчення фарбування препарат промити струменем води доти, доки вода, що стікає, стане безбарвною. У правильно зафарбованому і добре промитому препараті фон залишається чистим, а зафарбованими є лише клітини мікроорганізмів. Потім препарат висушити на повітрі або обережно промокнути фільтрувальним папером і мікроскопувати з імерсією.

При висушуванні мазків за допомогою листків фільтрувального паперу потрібно кожного разу користуватися новими, так як при повторному вживанні переносяться забарвлені бактерії з одного мазка на інший, що може привести до невірних висновків.