Литература

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 87, 98-108.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 129-137.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 78-86, 100.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 122-137.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 129-145, 157-159.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 92-102.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 73-77, 81-84.

8. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – С. 36-43.

9. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

10. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 84-88.

Занятие 4

ТЕМА: Регуляция ферментативных процессов. Ингибиторы и активаторы ферментов. Медицинская энзимология. Количественное определение активности α-амилазы и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови.

АКТУАЛЬНОСТЬ: Достижения энзимологии (науки о ферментах) широко внедряются в медицину. Развитие медицинской энзимологии происходит по трем главным направлениям: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия, что позволяет решать проблемы патогенеза энзимопатий, применять ферментные тесты для диагностики органических и функциональных расстройств органов и тканей, а также использовать ферменты и модуляторы их действия как лекарственные препараты. Так, повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови наблюдается при рахите, опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, вирусном гепатите, а снижение - при гипотериозе, гиповитаминозе С и др. Активность лактатдегидрогеназы увеличивается у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолях, остром гепатите. Ферменты - пепсин, трипсин, гиалуронидаза и другие - используются как лечебные препараты, а также в клинико-биохимических лабораториях как аналитические реактивы (глюкозооксидаза, уреаза и др.).

ЦЕЛЬ: Выучить и уметь анализировать механизмы регуляции ферментативных процессов как основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях; изменения хода ферментативных процессов и накопление промежуточных продуктов метаболизма при наследственных и приобретенных недостатках метаболизма – энзимопатиях; изменения активности индикаторных ферментов плазмы крови при патологиях определенных органов и тканей; применение ферментов и их модуляторов как фармакологических препаратов при определенных патологических состояниях. Ознакомиться с методами количественного определения активностей α-амилазы и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови и их клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ВО ВРЕМЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1.	Регуляция ферментативных процессов. Пути и механизмы регуляции: аллостерические взаимодействия; ковалентная модификация ферментов; действие регуляторных белков-эффек-торов (кальмодулина, протеиназ, протеиназных ингибиторов). Циклические нуклеотиды как регуляторы ферментативных реакций и биологических функций клетки.
2.	Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования ферментов: обратимое (конкурентное и неконкурентное) и необратимое. Примеры.
3.	Основные аспекты современной энзимодиагностики. Индикатор-ные, секреторные и экскреторные ферменты. Изоферменты в энзимодиагностике, тканевая специфичность распределения изоферментов. Изменения активности ферментов плазмы и сыворотки крови как диагностические показатели развития патологических процессов в органах и тканях. Применение энзимодиагностики в кардиологии, нефрологии, урологии, онкологии, пульмонологии, ортопедии и др.
4.	Нарушение протекания ферментативных процессов: наследственные и приобретенные энзимопатии, врожденные недостатки метаболизма, их клинико-лабораторная диагностика.
5.	Энзимотерапия – использование ферментов как лечебных средств. Фармакологическое применение ферментов желудочно-кишечного тракта, свертывающей и фибринолитической систем крови, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем. Ингибиторы ферментов как лекарственные препараты.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Укажите активатор амилазы слюны:

А. Хлорид натрия В. Сульфат аммония С. Сульфат меди

D. Хлорид магния Е. Глюконат кальция

2. Укажите тип ингибирования, при котором ингибитором фермента является продукт реакции:

А. Конкурентное В. Неконкурентное С. Бесконкурентное

D. Стереохимическое Е. Ретроингибирование

3. Укажите фермент, активность которого следует определять в моче пациента при остром панкреатите:

А. Амилаза В. Протеинкиназа С. Холинэстераза

D. Лейцинаминопептидаза Е. Щелочная фосфатаза

4. Укажите патологию, при которой активность амилазы крови возрастает в 10 и более раз: А. Вирусный гепатит В. Острый панкреатит

С. Хронический холецистит D. Инфаркт миокарда Е. Сахарный диабет

5. Укажите фермент, активность которого определяется в плазме крови пациентов с патологией костной ткани: А. Пепсин В. Трипсин С. Амилаза D. Кислая фосфатаза Е. Щелочная фосфатаза

6. Для оценки степени поражения паренхимы печени у пациентов используют тест определения:

А. Концентрации изоформ ЛДГ₁ и ЛДГ₂ плазмы крови

В. Концентрации изоформ ЛДГ₄ и ЛДГ₅ плазмы крови

С. Активности амилазы мочи D. Активности кислой фосфатазы

Е. Концентрации изоформы ЛДГ₃ плазмы крови

7. Укажите изоформы ЛДГ, концентрация которых увеличивается в плазме крови пациентов с инфарктом миокарда:

А. ЛДГ₁ и ЛДГ₂ В. ЛДГ₃ и ЛДГ₄ С. Только ЛДГ₃

D. ЛДГ₄ и ЛДГ₅ Е. Только ЛДГ₅

8. Укажите фермент плазмы крови, который используют в терапевтической практике для снижения кровяного давления:

А. Изоформа ЛДГ₁ В. Трипсин С. Химотрипсин

D. Холинэстераза Е. Калликреин

9. Какой механизм ингибирования синтеза фолиевой кислоты сульфаниламидными препаратами? А. Конкурентный В. Необратимый С. Денатурация фермента D. Неконкурентный

Е. Связывание с аллостерическими центрами ферментов

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Количественное определение активности α-амилазы в сыворотке крови методом Каравея

Задание 1. Определить активность α-амилазы в сыворотке крови методом Каравея.

Принцип метода. α-Амилаза (α-1,4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1.) катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием ко-нечных продуктов, не дающих окраски с йодом. Об активности фермента судят по избытку крахмала, который определяют по изменению окраши-вания йод-крахмального раствора спектрофотометрическим методом.

Реактивы: 1) Субстратно-буферный раствор (рН 7,0): 26,6 г натрия гидрогенфосфата; 8,6 г бензоатной кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения. 0,4 г крахмала растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и вливают в кипящий раствор. Кипятят на протяжении 1 минуты, после охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1 литра. 2) Основной раствор йода – 0,1 ммоль/л: 3,567 г калия йодата и 45 г калия йодида. Калия йодид растворяют в 800 мл дистиллированной воды, прибавляют 9 мл концентрированной хлоридной кислоты и доводят объем до 1 литра дистиллированной водой. 3) Рабочий раствор йода – 0,01 ммоль/л: 50 г феррум йодида, 100 мл основного раствора йода; доводят объем до 1 литра дистиллированной водой.

Ход работы. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови провести по следующей схеме:

Хими-ческая посуда	Объем пипетки, мл	Реактивы	Проба, мл	Контроль, мл	Этапы
Хими-ческие пробирки	1	субстратно-буферный раствор	1	1	пред- инкубация
	инкубировать 5 минут при температуре 37°С
	0,1	сыворотка крови	0,02	-
	смешать, инкубировать на протяжении 7,5 минут при температуре 37°С (ферментативная реакция)
	1	рабочий раствор йода	1	1	цветная реакция
	0,1	сыворотка крови	-	0,02
		Дист. вода	до 10	до 10
	смешать, измерить Епр и Ек при длине волны 630-690 нм в кювете (10 мм) против дистиллированной воды на протяжении 5 минут (фотометрия)

Активность α-амилазы в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

Ек - Епр

активность α-амилазы г/л∙ч = -------------- ∙ 160 ∙ К, где

Ек

Ек – экстинкция контроля; Епр – экстинкция пробы; 160 – коэффициент расчета, который учитывает количество крахмала, введенного в пробу и контроль, на 1 л биологической жидкости за 1 час инкубации при температуре 37°С; К – коэффициент разбавления исследуемой сыворотки крови.

Клинико-диагностическое значение работы. В норме активность α-амилазы в сыворотке крови составляет 12-32 г/(ч∙л). Повышение активности α-амилазы в крови и моче наблюдают при заболеваниях поджелудочной железы. При остром панкреатите активность α-амилазы повышается в 10-30 раз, максимальную активность обнаруживают в первые сутки болезни, а затем она быстро нормализуется на 2-6 сутки. Гиперамилаземию наблюдают при остром аппендиците, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки, холецистите, разрыве желчного пузыря, ожогах, травматическом шоке, пневмонии, простатите, уремии. Повышению активности α-амилазы способствуют лекарственные препараты (кортикостероиды, катехоламины, фуросемид, антикоагулянты), наркотики, алкоголь. Снижение активности α-амилазы наблюдают при гепатите, циррозе, злокачественных новообразованиях печени, сахарном диабете, гипотиреозе, кахексии.

Количественное определение активности лактатдегидрогеназы

(КФ 1.1.1.27) в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Задание 2. Определить активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по методу Савела и Товарека.

Принцип метода. Под влиянием ЛДГ L-лактат в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД) окисляется в пируват. Количество образовавшегося пирувата определяют фотометрически по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в которой образуется 2,4-динитрофенилгидразон, имеющий красно-бурую окраску в щелочной среде, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию кетокислоты. ЛДГ

СН₃-СН(ОН)-СООН + НАД⁺ → СН₃-СО-СООН + НАДН(Н⁺)

лактат пируват

Ход работы. В одну пробирку вносят 0,1 мл в 3 раза разбавленной сыворотки крови; 0,3 мл свежеприготовленного раствора 0,02 моль/л НАД⁺ и ставят на 5 минут на водяную баню при 37°С для нагревания смеси. В другую пробирку вносят 0,8 мл раствора 0,03 моль/л натрия пирофосфата, 0,2 мл раствора 0,45 моль/л натрия лактата и нагревают на водяной бане при 37°С. Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой и отмечают время начала инкубации. Через 25 минут реакцию прекращают добавлением 0,5 мл 0,2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в растворе 1 моль/л хлоридной кислоты и оставляют пробирку на 20 минут при комнатной температуре для образования гидразона. К смеси прибавляют 5 мл раствора 0,4 моль/л натрия гидроксида, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 минут измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЕК при длине волны 520-560 нм в кюветах толщиной 10 мм. Контрольную пробу готовят также как и опытную, но разбавленную сыворотку прибавляют после инкубации. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробир-ки	Рабочий стандарт-ный раствор натрия пирувата, мл	Раствор 0,03 моль/л натрия пирофос-фата, мл	Дист. вода, мл	Концент-рация пирувата в пробе, мкмоль	Единицы актив-ности ЛДГ ммоль/ л∙ч	Экс-тинк-ция
1	0,1	0,8	0,5	0,01	1,2
2	0,2	0,8	0,4	0,02	2,4
3	0,4	0,8	0,2	0,04	4,8
4	0,6	0,8	-	0,06	7,2
5	0,8	0,8	-	0,08	9,6

На оси ординат откладывают значение экстинкции, а на оси абсцисс - соответствующие им единицы активности ЛДГ, которые выражены в ммоль/л∙ч.

Клинико-диагностическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики заболеваний, а также как тест на выздоровление. В норме активность фермента в сыворотке крови составляет 0,8-4,0 ммоль/л∙ч. Активность ЛДГ повышается при повреждении миокарда, лейкозе, болезни почек, гемолитической и серповидноклеточной анемии, тромбоцитопении, инфекционном мононуклеозе, а также при прогрессирующей мышечной дистрофии. При болезнях, которые сопровождаются некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатит, панкреатит, опухоли), наблюдают резкое повышение активности ЛДГ в сыворотке крови. При остром гепатите активность ЛДГ в сыворотке крови повышается в первую неделю желтушного периода, при легкой и средней степени тяжести болезни активность фермента быстро нормализуется. У больных с острым инфарктом миокарда наблюдается повышение активности общей ЛДГ и ЛДГ₁ в сыворотке крови через 8-18 часов после начала приступа, которое достигает максимума через 24-72 часа. Активность ферментов остается высокой на протяжении первой недели и нормализуется на 6-10 день. Также имеет значение определение соотношения ЛДГ₁/ЛДГ₂, которое в норме составляет 0,4-0,74, а при остром инфаркте миокарда возрастает в 5-10 раз. При стенокардии активность ЛДГ в сыворотке крови не повышается.