Занятие 3

ТЕМА: Механизм действия ферментов и кинетика ферментативных реакций. Определение активности ферментов.

АКТУАЛЬНОСТЬ: Современная биохимия характеризуется широким применением методов определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях. Это позволяет установить патогенез многих заболеваний и предложить методы их лечения с использованием современных лекарственных средств.

ЦЕЛЬ: Выучить и уметь анализировать механизмы действия ферментов и кинетику ферментативных реакций. Ознакомиться с методами качественного и количественного определения активности ферментов в биологических объектах, которые позволяют не только изучить свойства ферментов, особенности их действия и регуляции, но и составляют основу для диагноза и прогноза многих заболеваний. Ознакомиться с методом определения специфичности действия ферментов α-амилазы слюны и сахаразы дрожжей.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ВО ВРЕМЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1.	Современные положения о механизме действия ферментов: понятие об энергии активации реакции; образование фермент-субстратного комплекса и механизмы получения продуктов ферментативной реакции (ковалентный и кислотно-основный катализ). Значение работ Е. Фишера и Д. Кошленда.
2.	Кинетика ферментативных реакций: влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции (графические зависимости). Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса, ее определение и значение.
3.	Активность ферментов. Единицы измерения активности и количества ферментов: международные единицы, катал, удельная активность фермента.
4.	Факторы, которые влияют на активность ферментов: концентрация субстрата, концентрация фермента, концентрация продуктов реакции, температура, рН среды.
5.	Методы выделения ферментов из биообъектов, их фракциониро-вание (ультрацентрифугирование, гель- и ионнообменная хрома-тография, аффинная хроматография, электрофорез) и анализ актив-ности ферментов.
6.	Методы определения активности ферментов: по количеству продукта, который образуется под действием фермента в единицу времени; по количеству израсходованного субстрата в единицу времени. Спектрофотометрические методы определения активности ферментов и визуализация результатов ферментативной реакции.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Константа Михаэлиса для фермента определяет:

А. Степень сродства фермента к продукту реакции

В. Степень сродства фермента к субстрату

С. Степень сродства фермента к ингибитору

D. Среднюю скорость ферментативной реакции

Е. Максимальную скорость ферментативной реакции

2. Продолжите фразу «Незначительное изменение рН среды влияет на молекулу фермента, изменяя...»:

А. Структурный уровень организации молекулы фермента

В. Степень поляризации аминокислотных радикалов в активном центре

С. Толщину гидратной оболочки фермента

D. Оптические свойства фермента

Е. Биологическую функцию фермента

3. Укажите показатель, который используют при определении удельной активности фермента, зная его общую активность:

А. Концентрация данного фермента в исследуемой пробе

В. Концентрация белка в исследуемой пробе

С. Концентрация субстрата в исследуемой пробе

D. Константа Михаэлиса для данного фермента

Е. Максимальная скорость исследуемой ферментативной реакции.

4. Укажите фамилию ученого, который предложил гипотезу «индуцированного соответствия»:

А. Г. Кребс В. Д. Кошленд С. М. Ментен D. Ф. Крик Е. К. Функ

5. Выберите фактор, который не влияет на значение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса:

А. Концентрация субстрата В. Химическая природа фермента

С. Концентрация фермента

D. Концентрация фермент-субстратного комплекса

Е. Степень сродства фермента к субстрату

6. В ходе ферментативного катализа при образовании фермент-субстратного комплекса:

А. Изменяется конформация субстрата

В. Изменяется конформация фермента

С. Устанавливается индуцированное комплементарное соответст- вие между ферментом и субстратом

D. Сближаются функциональные группы, которые принимают

участие в катализе

7. Какое из перечисленных свойств ферментов лежит в основе их качественного и количественного определения в биологических объектах?

А. Способность проявлять максимальную активность при опреде- ленном значении рН среды

В. Зависимость от присутствия в среде разнообразных актива- торов и ингибиторов

С. Специфичность D. Термолабильность

Е. Торможение реакции ее продуктами

8. В пробирку с неизвестным субстратом прибавили экстракт из дрожжей. После 15 минут инкубации смесь в пробирке дала положительную реакцию Фелинга. Какой субстрат был в пробирке?

А. Крахмал В. Сахароза С. Лактоза D. Гликоген Е. Целлюлоза

9. После 10 минут инкубации крахмала со слюной реакционная смесь дает желтый цвет с йодом и положительную реакцию Фелинга. В среде присутствуют:

А. Амилодекстрины В. Мальтоза и глюкоза

С. Сахароза D. Эритродекстрины

10. Какое явление лежит в основе механизма действия ферментов?

А. Сближение групп, которые входят в активный центр фермента

В. Образование фермент-субстратного комплекса

С. Изменение электрического заряда фермента

D. Изменение пространственной конфигурации

Е. Гидролиз фермента

11. Укажите метод исследований, который используется для выделения ферментных систем отдельных субклеточных фракций из гомогената ткани: А. Диализ В. Изоэлектрическое фокусирование

С. Качественный анализ D. Дифференциальное центрифугирование

Е. Рентгеноструктурный анализ

12. Укажите единицу активности фермента, которая определяется количеством фермента, превращающего 1 моль субстрата за 1 секунду при оптимальных условиях:

А. Катал В. Стандартная международная единица

С. Условная единица D. Число оборотов

Е. Молярная активность

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение специфичности действия ферментов α-амилазы слюны (α-1, 4-глюканогидролазы; КФ 3.2.1.1) и сахаразы дрожжей (β-D-фруктофуранозидфруктогидролазы; КФ 3.1.1.26)

Задание 1. Приготовить экстракт из дрожжей, содержащий фермент сахаразу.

Ход работы. Растереть в ступке кусочек дрожжей с 10-15 мл дистиллированной воды и профильтровать.

Задание 2. Проверить действие амилазы на крахмал и на сахарозу.

Принцип. Об активности фермента судят по его действию на субстрат: либо по исчезновению субстрата, либо по появлению продуктов. Расщепление крахмала обнаруживают по отрицательной реакции с реактивом Люголя. Расщепление сахарозы обнаруживают по положительной реакции с реактивом Фелинга, которую дают продукты гидролиза сахарозы (глюкоза и фруктоза), но не дает сахароза.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл слюны: в первую добавляют 3-5 мл 1 % раствора крахмала, во вторую – 3-5 мл 1% раствора сахарозы, хорошо перемешивают и ставят в водяную баню или термостат при 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в гидролизе крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в отсутствии гидролиза сахарозы.

Техника реакции Фелинга: К 1-2 мл исследуемого раствора добавляют равный объем реактива Фелинга (CuSО₄ + NaOH) и кипятят в пламени горелки. При наличии в растворе веществ, обладающих реду-цирующими группами (например, моносахаридов), выпадает осадок красного цвета (Сu₂О), образующийся в результате восстановления меди за счет окисления карбонильных групп моносахаридов.

Задание 3. Проверить действие сахаразы на крахмал и cахарозу. Принцип: тот же.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5-1 мл экстракта дрожжей; в первую добавляют 3-5 мл 1% раствора крахмала, во вторую - 3-5 мл 1% раствора сахарозы; хорошо перемешивают и ставят в водяную баню или термостат при температуре 37°С на 15-20 мин. После этого в первую пробирку добавляют 3-4 капли реактива Люголя и убеждаются в отсутствии гидролиза крахмала; с содержимым второй пробирки проводят реакцию Фелинга и убеждаются в наличии гидролиза сахарозы.

Оформление работы: заполнить таблицу.

№ проб- Бирки

Фермент

Субстрат

Условия опыта

Результаты реакции

Выводы

Практическое значение работы. Ферменты, которые имеют абсолютную субстратную специфичность, используются в клинике как аналитические реагенты для определения веществ, являющихся их субстратами. Например, уреаза используется для определения мочевины в биологическом материале и лекарственных препаратах; глюкозооксидаза - для определения количества глюкозы в крови и моче. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью имеют меньшую избирательность действия на субстраты, принимают участие, как правило, в гидролизе питательных веществ или в преобразовании чужеродных соединений. Например, α-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, имеющих место в соответствующих углеводах.