Определение концентрации холестерола в сыворотке крови ферментативно по набору реактивов

Задание. Определить концентрацию холестерола в сыворотке крови.

Принцип. Вследствие гидролиза эфиров холестерола холестеролэсте-разой образуется свободный холестерол. Образовавшийся вследствие гидролиза и присутствующий в крови холестерол окисляется кислородом воздуха при участии холестеролоксидазы с образованием эквимолярных количеств гидроген пероксида. При участии пероксидазы гидроген перок-сид окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного соеди-нения, интенсивность которого пропорциональна концентрации холесте-рола в крови и определяют фотометрически при длине волны 540 нм.

Ход работы. В штатив поместить 3 химические пробирки, обозначить – проба, калибровочная, холостая. Отмерить по 0,01 мл сыворотки крови в пробу; 0,01 мл калибровочного раствора в калибровочную; 0,01 мл дистиллированной воды в холостую. Отмерить 1 мл раствора реагента и прибавить соответственно в пробу, калибровочную и холостую. Содержимое пробирок перемешать и выдержать на протяжении 10 минут при температуре 37°С или на протяжении 20 минут при комнатной температуре. Измерить экстинкцию пробы и калибровочной против холостой при длине волны 540 нм. Рассчитать концентрацию холестерола в сыворотке крови по формуле:

С = Еп/Ек ∙ 5,2, где С - концентрация холестерола в пробе, ммоль/л; Еп - экстинкция пробы; Ек - экстинкция калибровочной; 5,2 - содержание холестерола в калибровочном растворе, ммоль/л.

В случае концентрации холестерола больше 19,4 ммоль/л, пробу необходимо разбавить изотоническим раствором натрия хлорида и полученный результат умножить на коэффициент разведения.

Клинико-диагностическое значение работы. Экзогенный холестерол в количестве 0,3-0,5 г в сутки поступает с пищей, а эндогенный - синтезируется в организме: 0,8-2 г в сутки. Особенно много синтезируется холестерола в печени, кишечнике и коже. Богата холестеролом нервная ткань (20-30 г/кг). Концентрацию холестерола определяют в комплексе с другими тестами для типирования гиперлипопротеинемии. Концентрация холестерола в сыворотке крови у здоровых людей составляет в норме 3,0-5,2 ммоль/л. Длительное повышение концентрации холестерола в крови способствует развитию атеросклероза. В патогенезе атеросклероза ведущую роль играют липопротеины. Установлено, что атеросклероз и связанные с ним заболевания возникают при значительном повышении в плазме крови фракций ЛПНП, а во многих случаях и фракций ЛПОНП. Показано, что хиломикроны не могут проникать вглубь сосудистой стенки из-за своих больших размеров, а ЛПВП, ЛПНП и частично ЛПОНП это свойство имеют. Однако ЛПВП имеют среди липопротеинов наименьшие размеры и легче удаляются из стенок сосудов через их лимфатическую систему. Кроме того, ЛПВП, имея в своем составе наиболее высокое содержание белков и фосфолипидов, могут быстрее метаболизироваться в сосудистой стенке и легче выводиться из нее, чем богатые холестеролом и триглицеридами ЛПНП и ЛПОНП. Именно последние, атерогенные липопротеины, способны проникать в сосудистую стенку из плазмы крови и служить в дальнейшем первичным субстратом, который вызывает атеросклеротические поражения артерий. Гиперхолестери-немию наблюдают у больных гипертонией, ишемической болезнью сердца, при сахарном диабете, ожирении, механической желтухе, неф-рите, нефрозе, сифилисе, гипотиреозе. Снижение концентрации холесте-рола (гипохолестеринемия) - при туберкулезе, сыпном тифе, паренхима-тозной желтухе, гипертиреозе, анемии, раковой кахексии, лихорадочных состояниях, некоторых нарушениях ЦНС, в случае голодания.