Количественное определение содержания β- и пре-β-липопротеинов и общих липидов в сыворотке крови

Задание 1. Определить содержание β- и пре-β-липопротеинов в сыворотке крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай.

Принцип. Метод базируется на способности гепарина образовывать с β-липопротеинами и пре-β-липопротеинами сыворотки крови комплекс, который под действием кальция хлорида выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию этих липопротеинов в сыворотке крови.

Ход работы. В 5 мм кюветы ФЕК наливают по 2 мл раствора 0,025 моль/л кальция хлорида. Устанавливают «нуль» при длине волны 720 нм (красный светофильтр). В одну кювету приливают микропипеткой 0,2 мл сыворотки, несколько раз промывают пипетку. Отмечают начальное значение экстинкции Е₁. Затем прибавляют микропипеткой 0,04 мл раствора гепарина, который содержит 1000 единиц в 1 мл, несколько раз промывают пипетку. Перемешивают содержимое кюветы. Ровно через 4 минуты (по секундомеру) снова измеряют экстинкцию Е₂. Содержание β- и пре-β-липопротеинов Х в г/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле: Х = (Е₂ – Е₁) ∙ 11,65, где 11,65 – эмпирический коэффициент пересчета содержания β- и пре-β-липопротеинов в г/л.

Клинико-диагностическое значение работы. При ультрацентри-фугировании крови выделяются липопротеины разной плотности: высокой (ЛПВП) - α-липопротеины, низкой (ЛПНП) - β-липопротеины, очень низкой (ЛПОНП) - пре-β-липопротеины и др. Фракции липопро-теинов отличаются количеством белка и содержанием отдельных ли-пидных компонентов. Так, α-липопротеины содержат большое количество белка (50-60%), имеют и более высокую относительную плотность (1,063-1,210), тогда как β-липопротеины и пре-β-липопротеины содержат меньше белка, значительное количество липидов - до 95% массы и имеют низкую относительную плотность (1,010-1,063).

В норме содержание липопротеинов сыворотки крови составляет 3,6-6,5 г/л. Повышение уровня липопротеинов тесно связано с увеличением количества холестерола в крови; им богаты β-липопротеины. Увеличение содержания β- и пре-β-липопротеинов наблюдают при атеросклерозе, сахарном диабете и других заболеваниях.

Задание 2. Определить содержание общих липидов в сыворотке крови.

Принцип. Метод базируется на способности продуктов распада ненасыщенных липидов образовывать с фосфатнованилиновым реакти-вом окрашенное соединение; интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Ход работы. В сухую опытную пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и осторожно 2,9 мл концентрированной сульфатной кислоты, а в контрольную – 0,2 мл воды и 5,8 мл концентрированной сульфатной кислоты. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на кипящую водяную баню на 10 минут (осторожно!). Затем обе пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуре. Из опытной пробирки отбирают 0,2 мл, а из контрольной – 0,4 мл охлажденной смеси в другие пробирки, в которые заранее наливают фосфатнованилиновый реактив (фосфатнованилиновый реактив: 4 части концентрированной ортофосфатной кислоты смешивают с 1 частью 0,6% водного раствора ванилина): в опытную – 3 мл, в контрольную – 6 мл. После тщательного перемешивания стеклянной палочкой пробы ставят на 45 минут в темное место при комнатной температуре для развития окраски.

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЕК при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Содержание общих липидов Х в г/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

Х = m ∙ 10 000 ∙ 3/0,2 ∙ 1000, где m – масса общих липидов пробы, найденная по калибровочному графику, мг; 10 000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови; 1000 – коэффициент пересчета мг в г; 3 – общий объем начальной смеси (0,1 мл сыворотки крови + 2,9 мл концентрированной сульфатной кислоты), мл; 0,2 мл – объем смеси, взятой для проведения цветной реакции, мл.

Клинико-диагностическое значение работы. Содержание липидов крови (в частности триглицеридов, фосфолипидов, холестерола) в комплексе с белками (альбуминами) и в форме липопротеинов является важным диагностическим показателем. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови составляет 4-8 г/л. Как физиологическое явление увеличение содержания липидов в крови (гиперлипидемия) происходит через 1-4 ч после потребления богатой липидами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипидемия). Увеличение концентрации липидов в крови наблюдается при диабете (до 10-20 г/л), циррозе печени, ожирении, ишемической болезни сердца, липоидном нефрозе (заболевание почек), атеросклерозе, остром гепатите, панкреатите у лиц, которые злоупотребляют алкоголем.