Прямые методы лабораторной диагностики.

Для лабораторной диагностики инфекции используется следу4ющие прямые методы

Микроскопические.

Бактериологические.

Биологические.

Полимеразная цепная реакция.

Микроскопические методы

Позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в исследуемом патологическом материале с помощью всевозможных микроскопов.

Микроскопический метод является одним из самых информационных методов в диагностике инфекций. Наиболее широко применяется микрокопирование микробов в определенном состоянии. Эта методика имеет много достоинств, позволяющих, изучить морфологические особенности микроорганизмов и может играть решающую роль при диагностике менингококковой инфекции, туберкулеза, гонореи, а так же при заболеваниях вызванными простейшими (малярия, лямблиоз, амёбиаз).

Микроскопическому методу исследования подвергаются различные биологические материалы, полученные от больных: кровь, мазки со слизистых оболочек глотки, небных миндалин, носа, мочу, отделяемое уретры, спинномозговая жидкость, вытяжка из костного мозга, мазки отпечатков карбункулов или фурункулов.

Из полученного биологического материала в лаборатории с помощью различных технологий готовят мазки. После приготовление мазка его высушивают, фиксируют и окрашивают. Простая окраска, для которой используется только один краситель (фуксин, метиленовый синий) позволяет ознакомиться с общей морфологией микроба. Сложные способы окраски применяются для дифференциации микробов. Наибольшее практическое значение имеет окрашивание по Граму, Цилю-Нильсону, Нейссеру и др. Применяют также метод изучения микробов в живом, некрашеном виде. Этот метод имеет то преимущество, что микробы изучаются в неповреждённом виде. Метод обычно применяется для определения подвижности микроорганизмов и для изучения тонкой структуры крупных паразитов (грибов, простейших)

К микроскопическим методам обследования можно также отнести люминисцентно-серологический метод (иммуно-флюорисценция), нашедший применения в основном для диагностики вирусных инфекций. Используются специфические диагностические антитела, меченные флюоресцирующими красками. Соединение меченых антител с антигенами микроорганизмов даёт возможность судить о наличие и локализации антигена (токсина). Результат реакции учитывается при рассматривании препарата в люминесцентном микроскопе. Метод этот обладает высокой чувствительностью и характеризуется универсальностью применения для обнаружения различных антигенов, как в живых, так и в мертвых клетках. Наиболее часто этот метод лабораторной диагностики применяют при вирусных инфекциях, другие методы микроскопического исследования вирусов применяются сравнительно редко.

Кроме нахождения микроорганизмов, для диагностики инфекций, изучают посторонние включения в отдельных клетках, скоплении вибрионов и продуктов реакции клеток - тельца Бабеша-Негри при бешенстве и т.д.

Используется так же люминесцентная микроскопия, позволяющая обнаружить внутриклеточные или внутриядерные включения, содержащие вирусные нуклеиновые кислоты.

Бактериологические методы

Бактериологические методы дают возможность получить чистую культуру возбудителя болезни, что необходимо для комплексного исследования культурных, морфологических, биохимических, антигенных и других свойств возбудителя. В практике чаще приходится иметь дело с биологическим материалом, содержащим смесь микроорганизмов. Выделение возбудителя в чистом виде является основой бактериологического исследования. Нужно помнить, что способ забора биологического материала для исследования очень сильно влияет на эффективность конечного результата.

Обязательные правила при заборе биологического материала для бактериологического исследования:

1. Материал нужно забирать до начала этиотропной терапии.

2. Строго соблюдать стерильность при заборе.

3. Категорически запрещается обрабатывать посуду дезинфицирующими растворами (посуду стерилизуют сухим паром или ополаскивают кипятком).

4. Добиваться минимального промежутка времени между забором материала и посевом на питательные среды, при невозможности посева в первые 3 часа используют консервирующие смеси (водно-глицериновая 7:3, Кери-Блера и др.). При отсутствии консервантов, материал хранят в холодильнике или на льду.

Бактериологическому исследованию подвергают все биологические материалы.

Исследуемые материалы высевают на питательные среды, используя специальную методику посева, получают отдельные колонии, которые далее пересевают в пробирки с косым агаром. Для культивирования микроорганизмов используются различные питательные среды: простые (мясо-пептоный бульон, агар) и сложные (сывороточная среда).

Для выделения и накопления микроорганизмов применяют консервирующие среды (глицериновая смесь), среды обогащения (щелочная пептонная вода) и элективные (избирательные) среды (желчный бульон). В ряде случаев питательные среды применяют для определения микроорганизмов (среды Эндо, Левина, Плоскарева – для диагностики кишечных бактерий).

Характер роста микроорганизмов (культурные свойства) является одним из критериев для его распознавания. Значение имеют величина, форма, консистенция, плотность, цвет, поверхности колоний на плотных питательных средах, а в бульоне - наличие мути, осадка, плёнки.

Одним из основных диагностических методов при распознавании микроорганизмов является изучение их биохимических свойств. Особое значение это имеет при диагностике кишечных инфекций. Изучается способность микроорганизмов сбраживать углеводы с образованием кислоты или кислоты с газом, разлагать белковые продукты, способность образовывать католазу и др.

Для обнаружения всех свойств материал помещают на дифференциально-диагностические среды, содержащие вещества, в отношении которых микроорганизмы проявляют свою ферментативную активность. Добавление в среду индикаторов меняющих цвет среды дает возможность легко узнавать результаты. Этот метод бактериологической диагностики называется - ''посев на пестрый ряд».

Обнаружение возбудителей вирусных инфекций имеет свои особенности, обусловленные особенностями вирусов – внутриклеточным паразитированием. Для культивирования вирусов используют куриные эмбрионы и культуры тканей. Чаще применяют куриные эмбрионы на 8-12 день инкубации. Материал вводят в амниотическую полость, в желточный мешок или на оболочки. Зараженные яйца помещают в инкубатор на 3-10 дней. Срок инкубации зависит от вируса, способа заражения и цели исследования.

Культурами тканей называют смесь клеток, которые способны существовать вне организма. Вирусы культивируются во всех культурах тканей. В культуре тканей вирусы определяются по целому ряду признаков и показателей.

Биологические методы.

Биологическими методами называют методы заражения лабораторных животных. Воспроизведение заболевания у животных является абсолютным показателем патогенности микроорганизмов. Для исследования биологических свойств паразитов используются только наиболее чувствительные к ним животные (при туберкулёзе - морские свинки, при пневмококковой инфекции и сибирской язве - белые мыши, при стрептококковой инфекции - кролики и т.д.).

Метод заражения лабораторных животных чаще применяется при вирусных инфекциях. Место введения биологического материала выбирают с учётом тропизма (сродства) исследуемого вируса к определённым тканям животного и человека (нейротропные - вводят в мозг, пневмотропные - в трахею и т.д.).

После заражения животных размножение паразитов в них устанавливают:

1. По клинической картине;

2. По патофизиологическому изменению в организме животного;

3. По нахождению микроорганизмов в организме животного;.

4. По нахождению антител в сыворотки крови животного:

В некоторых случаях лабораторных животных используют для выделения чистой культуры, при введении сильно загрязненного материала, различными патогенными микроорганизмами. После смерти животного из его организма выделяют чистую культуру. С помощью лабораторных животных можно также определить вирулентность выделенного патогенного штамма микроорганизмов.

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция является совершенно новым видом прямой диагностики заболеваний. ПЦР была открыта в первой половине 20 века американским ученым биохимиком (За ПЦР в дальнейшем он получил Нобелевскую премию)

Суть реакции заключается в том, что берется любой биологический материал

и с помощью компьютерных технологий в нем отыскивают обломки (геномы) ДНК или РНК микроорганизмом. Этот метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом материале без выделения его в питательной культуре, но, к сожалению, он применяется редко, т.к. дорогостоящ и сложен по проведению, требует специального диагностического оборудования подготовки персонала