4. Реакция фотолиза.

Фотохимия родопсина

По предложенной Wald классификации все известные зрительные пигменты могут быть разделены на два типа: первые из них – родопсины – содержат в качестве хромофора 11-цис-региналь, вторые - порфиропсины – 11-цис-3,4-диде-гидроретиналь. Максимумы поглощения родопсинов в видимой области спектра варьируют у разных животных в пределах от 345 до 575 нм (например, у родопсина из палочек сетчатки быка 498 нм), а порфиропсинов – от 338 до 620 нм. Эти различия в положении максимума поглощения определяются белковым окружением хромофорной группы. Характерно, что один и тот же опсин может связываться как с 11-цис-ретиналем, так и с его 3,4-дидегидропроизводным. Основной максимум поглощения 11-цис-ретиналя находится около 380 нм. Его присоединение к белковой молекуле сопровождается значительным смешением максимума поглощения в длинноволновую область спектра. Батохромный сдвиг до 440 нм можно наблюдать в модельной системе при образовании протонированного шиффова основания между молекулами ретиналя и бутиламина. Дальнейший длинноволновый сдвиг обусловлен вторичными взаимодействиями между хромофором и его белковым микроокружением. Поглощение родопсином кванта света приводит к ряду фотохимических превращений – фотолизу, - продуктами которой являются полностью-транс-ретиналь и опсин. Собственно фотохимический процесс – стадия 11-цис® 11-транс-изомеризации ретиналя в составе хромофорной группы родопсина. Все остальные стадии фотолиза – темновые, они сопряжены с конформационными перестройками в молекуле родопсина и реакциями протонирования-депротонирования шиффова основания между ретиналем и ε-аминогруппой лизинового остатка опсина. На рис. 7 суммированы выявленные с помощью низкотемпературной спектрофотометрии и лазерного флеш-фотолиза основные интермедиаты фотохимических превращений родопсина, которые могут быть обнаружены как in vivo, так и in vitro.

Рис. 7. Схема фотолиза родопсина. На схеме указаны значения спектральных максимумов полос поглощения промежуточных продуктов фотолиза, время их жизни при комнатной температуре и температуры, при которых осуществим каждый из переходов.

Наибольшую важность для биохимических реакций, приводящих к возникновению фоторецепторного ответа, представляют интермедиаты, образующиеся на заключительных стадиях обесценивания родопсина, и среди них, в первую очередь, - мета-родопсинII. Появление этого интермедиата при комнатной температуре наблюдается примерно через 10^-3 сек после поглощения родопсином кванта света и сопровождается значительными конформационными перестройками в молекуле белка, о которых можно судить по переходу одного из остатков триптофана из гидрофобного окружения в водную фазу, приобретению шиффовым основанием способности взаимодействовать с боргидридом натрия и появлению доступности остатков и цистеина³²³ к действию модифицирующих реагентов. Образование метародопсина II сопровождается также падением светорассеяния суспензии фоторецепторных мембран и приобретением родопсином способности связывать трансдуцин и родопсинкиназу. С образованием метародопсина II связано и нарастание основной фазы [R₂] раннего рецепторного потенциала, в основе которого лежит перемещение электрического заряда в молекуле родопсина. В соответствии с наиболее общепринятой точкой зрения, основанной на анализе спектров резонансного комбинационного рассеяния продуктов фотолиза родопсина, образование метародопсина II сопровождается депротонированием альдиминной связи полностью-транс-ретиналя с ε-аминогруппой лизина²⁹⁶. Одновременно с депрогонированием шиффова основания при переходе метародопсин I ® метародопсин II еще несколько ионизируемых групп в молекуле родопсина отщепляют и присоединяют протоны. В результате образование метародопсина II сопровождается поглощением одного или двух протонов из среды. В этом смысле можно провести аналогию между родопсином и бактериородопсином. Различие же в работе этих белков сводится к тому, что в случае бактериородопсина протон освобождается на противоположной стороне мембраны, а в случае зрительного родопсина этого не происходит.

На рис. 7 видно, что метародопсин II находится в равновесии с метародопсином I, которое чувствительно к температуре и рН среды. Это равновесие сдвигается в сторону образования метародопсина II при повышении температуры и снижении рН (рис. 8).

Рис.8. Трехмерная диаграмма зависимости равновесия метародопсин I « метародопсин II от температуры и pH.

Время жизни метародопсина II при 37° С составляет около 100 сек. Его распад в опсин и полностыо-транс-ретиналь может происходить как напрямую, так и через образование метародопсина III, причем в физиологических условиях второй путь является предпочтительным.

Конечный продукт фотолиза родопсина – опсин – может быть вновь регенерирован в родопсин в темноте в присутствии 11-цис-региналя. Образование связи между опсином и ретиналем происходит самопроизвольно и не требует наличия каких-либо дополнительных факторов. При регенерации родопсина in vitro 11-цис-ретиналь быстро изомеризуется в смесь 13-цис- и полностью-транс-ретиналей под действием присутствующего в фоторецепторных мембранах фосфатидилэтаноламина, поэтому наиболее полная регенерация наблюдается в результате последовательного добавления небольших порций 11-цис-ретиналя к суспензии мембран. Способностью взаимодействовать с опсином in vitro обладает также 9-цис-ретиналь; в этом случае образуется изородопсин, имеющий максимум поглощения при 485 нм. Полностью-транс- и 13-цис-изомеры ретиналя не могут ковалентно связываться с опсином.