Уніфікований мікрометод визначення гематокриту (загального об’єму еритроцитів, модифікація і. Тодорова)

Принцип методу. Центрифугування крові впродовж певного проміжку часу при постійних обертах центрифуги із наступним визначенням результату за градуйованим капіляром.

Обладнання. Центрифуга, піпетки від апарату Панченкова (з відрізаним верхнім кінцем, довжиною 10–11 см).

Реактиви

1. Спирт – 70 ° розчин.

2. Гепарин – 5000 ОД/мл. Перед забором крові гепарин розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1:5. Замість гепарину як антикоагулянт можна використовувати етилендіамінтетраоцтової кислоти динатрієва сіль (ЕДТА Na₂, трилон Б), 40 г/л.

Хід роботи

Для попередження зсідання крові піпетки від апарату Панченкова промивають антикоагулянтом, висушують. Заповнюють кожну із них до верхньої мітки (на 100 поділок) кров’ю з пальця або вени і закривають з одного кінця спеціальною пастою (можна пластиліном). Піпетки зв’язують гумовим кільцем і поміщають в ротор центрифугу так, щоб закриті кінці прилягали до гумової прокладки. Центрифугують протягом 30–40 хв при 3 000 об/хв. Гематокритну величину визначають за градацією піпетки, вираховуючи зі 100 висоту стовпця еритроцитів.

Нормальні значення гематокриту:

чоловіки	44 ± 4 %
жінки	39 ± 3 %
новонароджені	45 ± 12 %
діти трьох місяців	38 ± 6 %
діти трьох-шести років	40 ± 4 %
діти десяти-чоритнадцяти років	41 ± 4 %

За системою СІ гематокритна величина в дорослих у нормі рівна 0,40–0,45 г/л.

Клініко-діагностичне значення. Показник гематокриту широко використовується для характеристики ступеня анемії, під час якої, як правило, спостерігається його зниження, інколи до 20–25 %. Значне підвищення гематокритної величини до 55–65 % є характерним при еритреміях, вторинному еритроцитозі, у новонароджених; підвищення до 50–55 % спостерігається при симптоматичних еритроцитозах, які супроводжують вроджені вади серця, легеневій недостатності, деяких гемоглобінопатіях. За величиною гематокриту характеризують гемоконцентраційні зсуви. Гематокрит знижується при гемодилюції. Використовують гематокрит для розрахунку показників, які відображають різноманітні характеристики еритроцитів: середній об’єм, середня концентрація гемоглобіну.

Оформлення роботи. Записати до протоколу основні етапи визначення гематокритної величини.

2.1.1.3. Визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом

Глюкозооксидазний метод полягає у визначенні вмісту глюкози на основі двох зв’язаних реакцій. Початкова реакція є специфічною, наступна – неспецифічна. В першій реакції під впливом глюкозооксидази глюкоза окиснюється киснем повітря до глюконової кислоти та пероксиду водню. Враховуючи, що глюкозооксидаза є високоспецифічною відносно β,D-глюкози, більшість препаратів ферменту містять фермент мутазу, яка каталізує перетворення α,D-глюкози в β-форму. Гідроген пероксид, що утворився в першій реакції, використовується в другій, індикаторній реакції, окиснюючи хромоген до кольорового продукту. Цей ферментативний процес каталізується пероксидазою. Інтенсивність забарвлення проби після проведення спряженої пероксидазної реакцій із застосуванням хромогенної суміші відповідає концентрації глюкози в крові. Оптичну густину утвореного забарвленого комплексу вимірюють фотометрично. Реакція протікає за схемою:

Глюкоза + О₂ + Н₂О → (глюкозооксидаза) Глюконат + Н₂О₂;

2Н₂О₂ + фенол + 4-аміноантипірин → (пероксидаза) кольоровий хіноімін + 4Н₂О.

У разі визначення вмісту глюкози використовують аналітичний набір реагентів різних фірм для ферментативного визначення глюкози в цільній крові та інших біологічних рідинах, які базуються на застосуванні вказаного методу. Вміст у плазмі (сироватці) сечової кислоти, глутатіону, креатиніну не впливає на хід аналізу.

Обладнання. Центрифуга, піпетки, штатив з пробірками, спектрофотометр або фотоколориметр, кювети.

Реактиви

1. “Реагент”. Суха суміш глюкозооксидози, пероксидази, хромогену із складниками 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0 (2,75 г). Приготування робочого реагента. Вміст флакону розчинити в 350 мл дистильованої води. Мутність розчину не заважає ходу аналізу і зникає після обробки проб хлоридною кислотою. Зберігається розчин при 0 – +8 °С в затемненому місці до трьох діб. Поява блакитного відтінку в розчині реагенту не знижує його якості. Примітка: при проведенні меншого числа аналізів на кожен аналіз зважують 27,5 ± мг реагенту і розчиняють в 3,5 мл дистильованої води.

2. Глюкоза. Калібрувальний розчин глюкози, 10 ммоль/л (стабілізований).

3. Стабілізувальний розчин – 134 мг натрій щавлевокислого і 850 мг натрій хлористого розчиняють у 100 мл дистильованої води. Розчин стабільний не менше одного тижня при 0 – +8 °С. Як стабілізатор можна використовувати тільки фізіологічний розчин (0,9 % NaCl).

4. Додатковий реактив: 0,8 М НСl (концентровану хлоридну кислоту розводять в 15 разів водою: 10 мл кислоти + 140 мл води).

Проведення аналізу. Довжина хвилі – 450 нм (спектрофотометр або фотоколориметр). Кювети – 1 см. Інкубація при кімнатній температурі (близько 20 °С).