2.2.3.7. Визначення фетального гемоглобіну на мазках крові

Принцип методу. Гемоглобін А елюють з мазків крові лимонно-кисло-фосфатним буфером, а фетальний гемоглобін еритроцитів периферичної крові, який залишається після елюції, дофарбовують метилвіолетом. При цьому фетальний гемоглобін забарвлюється у фіолетовий колір.

Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, кювета для забарвлення препаратів, скляні палички, секундомір, мікроскоп, рукавички.

Реактиви

1. Етиловий спирт – 80 % розчин.

2. Лимонно-кисло-фосфатний буфер (рН 3,2) для елюції: змішують 24,7 частин 0,2 М розчину Nа₂НРО₄ (356 г Nа₂НРО₄2Н₂О в 1 л дистильованої води) та 75,3 частини 0,1 М розчину лимонної кислоти (21,01 г лимонної кислоти в 1 л дистильованої води).

3. Метилвіолет – 1 % водний розчин.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8). Висушений тонкий мазок капілярної крові фіксують протягом 5 хв у 80 % етиловому спирті (можна робити мазок із крові, взятої з антикоагулянтом і розведеної фізіологічним розчином у співвідношенні 1:3). Сліди спирту змивають дистильованою водою, мазок висушують і елюють протягом 5 хв у буферному розчині. Розчин заздалегідь нагрівають протягом 30 хв при +37°С для видалення газів, які заважають елюції гемоглобіну А з мазка крові.

Під час елюції гемоглобіну А буферний розчин потрібно помішувати скляною паличкою для видалення пухирців газу з поверхні мазка. Елюйований мазок споліскують дистильованою водою і фарбують 1 % водним розчином метилвіолету протягом 2 хв, після чого препарат промивають водою і висушують.

При описаній методиці фарбування еритроцити, які містять фетальний гемоглобін (НЬF), пофарбовані у яскраво-ліловий (фіолетовий) колір, а еритроцити, що містили гемоглобін А – гемоглобін дорослого, видно у слідових кількостях. Еритроцити підраховують у кількості не меншій ніж 200 клітин, і обчислюють процентне співвідношення еритроцитів, що містять різні форми гемоглобіну.

Клініко-діагностичне значення. Трапляються еритроцити з різною інтенсивністю забарвлення у фіолетовий колір. Можна припустити, що фетальний гемоглобін у них міститься у різних концентраціях одночасно з гемоглобіном дорослих. Аналіз вмісту фетального гемоглобіну у крові важливий для діагностики деяких патологічних станів (анемія Кулі, серпоподібно-клітинна анемія, мікросфероцитарна анемія, гострі і хронічні лейкози, мієломна хвороба).

2.2.4. Серологічні дослідження крові

2.2.4.1. Визначення групи крові (системи АВ0) людини стандартними сироватками

2.2.4.2. Визначення групи крові (системи АВ0) людини за допомогою еритроцитів визначеної групи крові

2.2.4.3. Визначення групи крові та резус-фактора людини за допомогою тест-реагентів «Цоліклон»

2.2.4.4. Визначення титру α- і β-аглютинінів

2.2.4.5. Визначення резус-приналежності стандартними сироватками

2.2.4.6. Визначення резус-фактора методом кон’югації зі застосуванням желатину

2.2.4.7. Визначення титру неповних резус-антитіл методом кон’югації за допомогою желатину

2.2.4.8. Визначення крові на біологічну сумісність

Методи визначення величини крововтрати

1. Метод Лібова Об'єм крововтрати визначається після зважування серветок, які просочені кров'ю.  Об'єм крововтрати = В/2 х 15% (при крововтраті менше 1000 мл) Об'єм крововтрати = В/2 х 30% (при крововтраті більше 1000 мл),  де В - вага серветок, 15% і 30% - величина похибки на навколоплідні води, дезінфікуючі розчини.   2. Формула Нельсона  Процентне співвідношення загального об'єму крововтрати розраховується наступним чином:  (0,36 • вихідний об'єм крові / маса тіла) • гематокрит Вихідний об'єм крові (м/кг) = (24  /  (0,86 • вихідний гематокрит)) • 100   3. Визначення крововтрати за щільністю крові і гематокриту

Щільність крові, кг/мл	Гематокрит	Об'єм крововтрати, мл
1057-1054	44-40	До 500
1053-1050	38-32	1000
1049-1044	30-22	1500
Менше 1044	Менше 22	Більше 1500

  4. Шоковий індекс Альговера Шоковий індекс = ЧСС / АТс,  де ЧСС - частота серцевих скорочень АТс - систолічний артеріальний тиск  В нормі індекс Альговера = 1. За величиною індексу можна зробити висновок про величину крововтрати. 

Індекс Альговера	Об'єм крововтрати (у % від ОЦК)
0,8 та менше	10%
0,9-1,2	20%
1,3-1,4	30%
1,5 і більше	40%

  Примітка: індекс Альговера не інформативний у хворих з гіпертонічною хворобою.   5. Гематокритний метод Moore КВ = ОЦК(н) • (ГТ(н) - ГТ(ф)) / ГТ(н),  де КВ - крововтрата; ОЦК(н) - нормальний ОЦК; ГТ(н) - гематокрит у нормі (у жінок - 42);   ГТ(ф) - гематокрит фактичний, визначений після зупинки кровотечі та стабілізації гемодинаміки  Для орієнтовного визначення об'єму крововтрати у вагітних можливе використання модифікованої формули Moore:  КВ = (0,42 - ГТ(ф)) / М 75 • 0,42,  де, КВ - крововтрата (мл); М - маса тіла вагітної (кг); ГТ(ф) - фактичний гематокрит хворої (л/л) 6. По Burri

В перші години гострої крововтрати ступінь анемії, через велику втрату рідини, не є показником кількості втраченої крові. В зв'язку з цим ступінь крововтрати Д клінічно можна визначити за формулою Burri, %: Д = К + НgШІ, Де К - коефіцієнт (при кровотечах із шлунково-кишкового тракту К = 27, при порожнинних кровотечах К = 33, при пораненнях кінцівок К = 24, грудної клітки К = 22); ШІ - «шоковий індекс» - відношення частоти пульсу до висоті систолічного артеріального тиску (мм рт. ст.): ШІ = Ps/АТ. Ступінь крововтрати

Ступінь крововтрати	Еритроцити, х1012	Гемо- глобін, г/л	Гемато- крит, %	Дефіцит ОЦК, %	Дефіцит ГО, %
Легка	До 3,0	До 100	До 35	До 20	До 30
Середня	До 2,5	До 80	До 25	До 30	До 45
Тяжка	До 2,0	До 50	До 20	До 40	До 60
Вкрай тяжка	Менше 2,0	Менше 50	Менше 20	Більше 40	Більше 60

Література

Тодоров И. Клинические лабораторние исследования в педиатрии, 3-е изд. –София, 1961. – 263 с.

Білько Н. М. Методи експериментальної гематології. – К.: Видавничий дім «Києво-Могилянська академія», 2006. – 66 с. – Бібліогр.: с. 54.

Манастирська О. С. Клінічні лабораторні дослідження. – Вінниця: Нова книга, 2007. – 168 с.

73